На правах рукописи Дударева Людмила Анатольевна КЛИНИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ
advertisement
На правах рукописи Дударева Людмила Анатольевна КЛИНИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ У БОЛЬНЫХ РАННИМИ ФОРМАМИ СИФИЛИСА (КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) 14.00.11. – кожные и венерические болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2007 Работа выполнена на базе Федерального Государственного Учреждения «Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», ГКБ №14 им. В.Г. Короленко Департамента здравоохранения г. Москвы и Федерального Государственного Учреждения Науки «ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора». Научный руководитель: доктор медицинских наук Наталия Владиславовна Фриго Научный консультант: кандидат биологических наук Александр Евгеньевич Гущин Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Ольга Казимировна Лосева доктор медицинских наук Ольга Валентиновна Доля Ведущее научное учреждение: Российский Университет Дружбы Народов, г. Москва Защита состоится «___20__»_____июня_____2007г. в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д.208.115.01 при ФГУ «Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт Росздрава» по адресу: 107076, г. Москва, ул. Короленко д.3, стр.6. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Центральный научноисследовательский кожно-венерологический институт Росздрава» (г. .Москва). Автореферат разослан «__18___»________________мая___2007г. Учёный секретарь Диссертационного совета Кандидат медицинских наук Наталья Константиновна Иванова -2- Актуальность проблемы Несмотря на успехи, достигнутые в последние годы отечественной и зарубежной сифилидологией, проблема диагностики ранних форм сифилитической инфекции остается по-прежнему актуальной. Это определяется эпидемиологическими особенностями распространения инфекции: высокой контагиозностью специфических проявлений на коже и слизистых оболочках больных, опасностью заражения половых партнеров, возможностью развития врожденного сифилиса. В связи с несвоевременным установлением диагноза на ранних стадиях инфекции отмечается рост заболеваемости поздними формами сифилиса, нейросифилисом. Всё это не может не вызывать обеспокоенности, особенно если учитывать отрицательный прирост населения в Российской Федерации. Следует особо отметить патоморфоз сифилитической инфекции, который в последние десятилетия коснулся не только клинических, но и серологических особенностей заболевания. Данное обстоятельство вызывает необходимость разработки эффективных методов и алгоритмов диагностики сифилиса на ранних стадиях заболевания с учетом клинико-лабораторных данных (Островский А.Г., 2003). К проблемам диагностики ранних форм сифилитической инфекции на современном этапе относятся: недостаточно высокая чувствительность темнопольной микроскопии (ТПМ), трудность дифференциации патогенных трепонем и трепонем-сапрофитов; наличие «серологического окна» при первичном сифилисе, когда классические серологические реакции дают отрицательный результат; ложноположительные и ложноотрицательные результаты серологических реакций при других ранних формах инфекции – вторичном, скрытом раннем сифилисе. Лабораторная диагностика сифилиса осуществляется путем применения прямых и непрямых методов исследования. С целью решения вышеуказанных проблем создаются новые методы диагностики. При этом среди прямых методов наибольшее развитие получила полимеразная цепная реакция (ПЦР), а среди серологических методов – иммуноблоттинг (ИБ). Диагностическая чувствительность ПЦР во многом зависит от клинического материала, взятого для исследования (кровь, спинномозговая жидкость, рейц-серум сифилидов и др.). Наибольшая чувствительность достигается при исследовании отделяемого сифилидов ввиду большей концентрации возбудителя в материале для исследования. Специфичность метода во многом обусловлена правильным выбором мишени для амплификации. Наиболее специфичными, по данным литературы, являются 47kDa, po1A гены ДНК и 16s рибосомальный ген РНК Т.pallidum. Выявляя в исследуемом материале фрагмент ДНК, характерный только для данного возбудителя, -3- что обеспечивается нуклеотидной последовательностью праймеров, ПЦР-диагностикумы, в отличие от серологических методов, исключают проблемы, связанные с перекрестно-реагирующими антигенами, тем самым обеспечивая абсолютную специфичность. Вместе с тем, метод ПЦР при диагностике сифилиса пока носит исследовательский статус. Работы, посвященные сравнительному изучению данного метода в сравнении с другими прямыми методами детекции возбудителя сифилиса, представляют в России значительную редкость (Шахматов Д.А. 1999; Петухова И.И., 2002; Стрельченко О.В., 2002), что не позволяет разработать рекомендации по применению ПЦР при диагностике ранних форм сифилиса. Несмотря на широкое применение прямых методов исследования, на первом месте по частоте использования в диагностике сифилиса продолжают оставаться непрямые (серологические) методы. Итоговый результат, получаемый при постановке любой их серологических реакций на сифилис, зависит от содержания в испытуемой сыворотке крови специфических антител к антигенным детерминантам возбудителя сифилиса. Вместе с тем не все из применяемых методов исследования являются достаточно чувствительными при диагностике ранних стадий заболевания, что влечет за собой ошибки диагностики и несвоевременное назначение лечения. Это вызывает необходимость совершенствования диагностических методов и определения их роли среди общепринятых методов исследования. Одним из перспективных непрямых методов диагностики сифилитической инфекции является метод иммуноблоттинга (ИБ). Метод является одним из вариантов иммуноферментного анализа и заключается в одновременном выявлении антител к рекомбинантным антигенам бледной трепонемы, иммобилизованным на нейлоновых тестполосках. За счет высокой степени очистки рекомбинантных антигенов и одновременного выявления антител к наиболее иммуногенным детерминантам возбудителя сифилиса метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью (George R., 1998; Marangoni A., 2000, Backhouse J.L.,Nesteroff S.I., 2001; Sambri V. et al., 2001; Hagedorn HJ. et al., 2002). При сравнении IgM и IgG диагностикумов большинство зарубежных авторов отдает предпочтение IgG-иммуноблоттингу как более высокочувствительному на всех стадиях заболевания сифилисом (Кувшинов М.В. с соавторами, 2006; Baker-Zander S.A., 1986; Sanchez P.J., 1988; Schmidt B.L., 1994). Среди отечественных дерматовенерологов отношение к данному методу диагностики еще не сформировалось. Не установлена диагностическая значимость метода иммуноблоттинга у больных ранними формами сифилитической инфекции, не разработаны клинические рекомендации для использования этого метода при первичном, вторичном, скрытом раннем сифилисе, а также у лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом. -4- Целью настоящего исследования явилась клиническая оценка значимости использования современных методов диагностики (полимеразной цепной реакции и иммуноблоттинга) у пациентов с ранними формами сифилиса. В задачи исследования входило: 1. Изучить особенности клинического течения ранних манифестных форм сифилиса (первичного и вторичного) на современном этапе. 2. Провести сравнительное изучение клинической значимости полимеразной цепной реакции в сравнении с темнопольной микроскопией у больных с манифестными проявлениями при ранних формах сифилитической инфекции (первичный и вторичный сифилис). 3. Исследовать эффективность метода иммуноблоттинга при диагностике ранних форм сифилиса (первичный, вторичный и скрытый ранний сифилис) и у лиц, находившихся в половом контакте с больными сифилисом (ЛБПК). 4. Разработать рекомендации по применению полимеразной цепной реакции и иммуноблоттинга для диагностики ранних форм сифилиса. Научная новизна исследований: Впервые при диагностике ранних форм приобретенного сифилиса на большом клиническом материале показана высокая диагностическая эффективность полимеразной цепной реакции и иммуноблоттинга в сравнении с традиционными методами исследования: темнопольной микроскопией (ТПМ) и традиционно применяемыми для диагностики сифилиса серологическими тестами (иммуноблоттинг). Практическая значимость: Впервые в практике отечественной дерматовенерологии разработаны рекомендации по рациональному использованию методов ПЦР и иммуноблоттинга, позволяющие устанавливать своевременному диагноз при выявлению ранних больных формах сифилиса, сифилисом и что будет повышению способствовать уровня оказания медицинской помощи населению. Отмечены особенности современного клинического течения первичного и вторичного сифилиса, что будет способствовать уменьшению диагностических ошибок и своевременному выявлению заболевания. -5- Основные положения, выносимые на защиту: 1. Клиническое течение ранних манифестных форм сифилитической инфекции (первичного, вторичного сифилиса) в настоящее время имеет ряд особенностей в сравнении с данными дерматовенерологов конца ХIХ – первой половины ХХ века. 2. Метод ПЦР с использованием в качестве мишени гена tpp47 T.pallidum является более чувствительным методом при исследовании райц-серума сифилидов больных первичным и вторичным сифилисом в сравнении с прямым методом - темнопольной микроскопией. Специфичность метода ПЦР составляет 100%. 3. Метод линейного иммуноблоттинга имеет высокую чувствительность при диагностике ранних форм приобретенного сифилиса, превышающую чувствительность нетрепонемных и трепонемных тестов (кроме РИФабс) при первичном сифилисе и чувствительность нетрепонемных и трепонемных тестов при скрытом раннем сифилисе. Специфичность метода составляет 98%. 4. Методы ПЦР и иммуноблоттинга могут быть рекомендованы к применению на ранних стадиях сифилитической инфекции (первичный, вторичный, скрытый ранний сифилис, у лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом) в качестве дополнительных к регламентированным методам диагностики сифилиса. Апробация работы: Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на IX Всероссийском съезде дерматовенерологов, Москва, 2005; IX, XI и XII междисциплинарных симпозиумах «Новое в дерматовенерологии, андрологии, акушерстве и гинекологии: наука и практика», Москва, 2004,2006,2007гг. Публикации По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 168 страницах машинописного текст, включает 5 таблиц и 19 рисунков. Указатель литературы содержит 335 источников, из них 143 отечественных и 192 иностранных авторов. Содержание работы Материалы и методы 1. Этапы выполнения работы, исследованный контингент и материалы. В ходе проведения настоящей работы было обследовано 211 пациентов с ранними формами -6- сифилиса, в том числе 133 мужчины и 78 женщин в возрасте от 15 до 75 (средний возраст 28,9 лет). На первом этапе исследования проводилось изучение особенностей современного клинического течения первичного и вторичного сифилиса путем сопоставления частоты изучаемых признаков заболевания с данными литературы прошлых лет. В этой же группе больных было проведено сравнительное изучение диагностических возможностей ПЦР по выявлению возбудителя сифилиса – бледной трепонемы - в сравнении с другим прямым методом диагностики – темнопольной микроскопией. Клиническим материалом для проведения ПЦР и темнопольной микроскопии служил райц-серум сифилидов, полученный с одних и тех же высыпных элементов для исследования обоими методами. Для выполнения задач первого этапа на базе ГКБ №14 им. В.Г. Короленко и ряда кожно-венерологических диспансеров г. Москвы в период с января 2003 по февраль 2006 года был обследован 101 больной первичным и вторичным сифилисом, за исключением пациентов старше 75, моложе 15 лет и лиц с тяжелой сопутствующей соматической патологией, в том числе 28 женщин (27,7%) и 73 мужчины (72,3%). Диагноз первичного сифилиса был установлен у 19 человек (18,8%), в том числе у 14 мужчин и 5 женщин в возрасте от 15 до 52 лет; диагноз вторичного сифилиса - у 82 (81,2%) человек, в том числе у 58 мужчин и 24 женщин в возрасте от 15 до 75 лет. Сопутствующая патология (заболевания желудочно-кишечного тракта, сердечно-сосудистой и дыхательной систем, болезни половой сферы, дерматозы) регистрировалась у 51 человека. Сопутствующие, в том числе сочетанные ИППП (гонорея, трихомоноз, урогенитальный хламидиоз, ВИЧ-инфекция, бактериальный вагиноз, негонококковый уретрит) отмечены у 14-и человек. Группу контроля составили 118 пациентов с высыпаниями несифилитической этиологии на гениталиях и в полости рта. На втором этапе исследования проводилось изучение диагностических возможностей иммуноблоттинга при диагностике ранних форм сифилиса в сравнении с другими серологическими методами. Для этого были исследованы сыворотки крови 210 пациентов, обследованных в ФГУ «ЦНИКВИ Росздрава» в период с ноября. 2003 по сентябрь 2005г.г. Часть из них (110 человек, у которых диагноз сифилиса был установлен на основании данных клинического и лабораторного обследования) составила опытную группу, в которую вошли больные первичным (46 человек), вторичным (25 человек) и скрытым ранним сифилисом (25 человек), а также лица, бывшие в половом контакте с больными заразными формами сифилиса (ЛБПК, 14 человек). Группу контроля (100 человек) составили лица, свободные от сифилитической инфекции: 50 больных дерматозами и 50 доноров. -7- В качестве клинического материала на втором этапе исследования были использованы сыворотки крови пациентов, полученные стандартным способом. 2. Методы исследования Прямые методы исследования. Для получения сравнительных данных диагностической эффективности ПЦР и темнопольной микроскопии использовались: стандартный метод темнопольной микроскопии и метод ПЦР. При этом для выявления ДНК T. pallidum методом ПЦР использовался диагностикум «Амплисенс Treponema pallidum» производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора» (№ государственной регистрации ЛС- 000916 от 18.11.2005г.). В качестве мишени для амплификации в данной тест-системе применен фрагмент гена поверхностного антигена бледной трепонемы - tpp47 (PCR tpp47), который отсутствует у других видов рода Treponema. В случае несовпадения результатов ПЦР и ТПМ проводилось дополнительное тестирование образцов с помощью некоммерческой ПЦР-тест-системы, разработанной ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора» с праймерами к 16S-рибосомальному гену микроорганизмов рода Treponema и последующей обратной транскрипцией, позволявшей на основе полученной РНК выявлять ДНК бледной трепонемы (PCR-16SDNA). Входящие в состав тест-системы олигонуклеотидные праймеры позволяли амплифицировать фрагмент ДНК не только бледной трепонемы, но и ДНК других видов трепонем. В этой связи для видовой идентификации выявленных микроорганизмов определяли нуклеотидные последовательности фрагментов ДНК, амплифицированных в ходе выполнения PCR-16S-DNA. Для этого был использован метод секвенирования, который осуществляли на секвенаторе Gene Analyzer ABI Prizm 3100, производства Applied Biosystem с использованием реагентов согласно прилагаемому протоколу. Полученные данные анализировались с помощью программного обеспечения BLAST и международной базы данных генетической информации GenBank, что позволяло установить вид микроорганизма. В целях установления причин несовпадения результатов ПЦР и ТПМ проводилась также дифференциация сифилитической и герпетической этиологии эрозивно-язвенных высыпаний в области гениталий. Для этого образцы райц-серума одновременно исследовались на предмет выявления ДНК вируса простого герпеса I и II типа (ВПГ-1 и ВПГ-2). Данное исследование осуществляли с помощью ПЦР-диагностикума «Амплисенс HSV1/2» производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора». Серологические исследования. Использовались стандартные серологические методы диагностики, регламентированные Приказом № 87 «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса» от 26.03.2001 года: реакция микропреципитации (РМП), реакция -8- связывания комплемента (РСК), иммуноферментный анализ (ИФА), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), реакция иммунофлюоресценции с абсорбцией (РИФабс). Для постановки указанных реакций применялись зарегистрированные в Российской Федерации диагностикумы, выпускаемые на Российских и зарубежных предприятиях. Для постановки РИФабс, кроме того, использовался трепонемный антиген, полученный из 7-суточного орхита кролика (штамм Никольс). Метод иммуноблоттинга (ИБ) Для проведения исследований была применена зарегистрированная в Российской Федерации коммерческая тест-система «ИННО-Лиа Сифилис усовершенствованный» («INNO - Lia™ Syphilis Score» производства фирмы «INNOGENETICS N.V.», Бельгия). Основу тест-системы составляют нейлоновые тест-полоски (стрипы), фиксированные на подложке из нейтрального пластика. На каждый стрип в виде дискретных линий нанесены антигенные детерминанты Treponema pallidum: три рекомбинантных белка (TpN47, TpN17 и TpN15) и один синтетический пептид (ТmрА). Кроме этого, на каждом стрипе имеются четыре контрольные линии: одна анти-стрептавидиновая – для оценки корректности (валидности) проведения теста (при правильно проведенном исследовании эта полоса не окрашивается) и три калибровочные линии, по интенсивности окрашивания соответствующие 3+, 1+, ± (cut off). Калибровочная линия, соответствующая 3+, содержит иммобилизованные антитела против IgG человека и одновременно служит контролем внесения образца биологического материала. Оценка результатов реакции проводится путем сравнения интенсивности окрашивания полос, полученного с образцом испытуемой сыворотки (плазмы) крови с окрашиванием трех калибровочных линий (рисунок 1.). TpN47 TpN17 стрептавидин Контроли TmpA TpN15 Антигены 3+ 1+ ± Рисунок 1. Расположение антигенов T.pallidum в иммуноблоттинге (диагностикум INNO-LIA Syphilis Score) -9- Диагностикум дает возможность учитывать суммарный результат реакции по совокупности данных по всем детерминантам, а также (при необходимости изучить интенсивность иммунного ответа) проводить полуколичественную оценку результатов реакции по каждой антигенной детерминанте в отдельности. Методы статистики. Расчет средних значений показателей (М) с определением ошибки (m), среднего квадратического отклонения (), достоверности различий между показателями (t; p), частоты признаков (р) в выборке с вычислением ошибки (m) и достоверности различий между показателями проводился классическим методом с определением достоверности различий с помощью t-критерия Стьюдента и методом альтернативного варьирования. Статистический анализ проведен с помощью коммерческих пакетов программ Excel (Microsoft Office 2000) на персональном компьютере Pentium IV. Результаты исследования 1. Особенности современного клинического течения первичного и вторичного сифилиса. При изучении современных особенностей клинического течения ранних форм сифилиса у больных первичным сифилисом было отмечено некоторое преобладание эрозивных твердых шанкров (у 52,6% пациентов) над язвенными. Однако, по данным настоящего исследования, эрозивные шанкры встречались значительно реже, чем в конце ХIХ века (по данным А.Фурнье – в 8 случаев из 10 - 80%), что совпало с результатами современных авторов (В.Н.Бугорского, 2003; А.В. Вислобокова, 2006), отметивших по результатам собственных наблюдений и по литературным данным значительное увеличение частоты регистрации язвенных шанкров у больных первичным сифилисом в течение последних десятилетий ХХ века (с 25% в 1992г. до 66,7% к 2003г.), У больных первичным сифилисом выявлен значительный процент множественных первичных сифилом (47,4%), что коррелировало с данными авторов второй половины ХХ – начала ХХI века (Антоньев А.А.,1978 – 39,1%; О.Г.Калугина, 2003 г. – 46,5%) и существенно отличалось от более низких показателей встречаемости множественных твердых шанкров, отмеченных дерматовенерологами конца ХIХ века (Ге А., 1895 - 13,6%; А.Фурнье 1899 - 17,47%;) и дерматовенерологами первой половины ХХ века (Мещерский Г.И.,1936 - 20%; Григорьев П.Г.,1938 - 30%). Отмечена также высокая частота регистрации осложненных форм первичного сифилиса (фимоз, парафимоз), - у 31,6% пациентов, соответствующая данным, полученным П.М. Зориным (1974), О.К Шапошниковым. (1980) и А.В Вислобоковым. (2006). Регионарный лимфаденит был выявлен у всех обследованных (100%), что отличалось от показателей, полученных в исследовании О.Г.Калугиной, 2003 (отсутствие регионарного лимфаденита у 2.2% пациентов), - 10 - П.М. Зорина, 1974 (2,8%), Ю.К. Скрипкина, 1975 (4,4%), А.А. Антоньева, 1978 (6,3%) и не позволяет считать отсутствие регионарного склераденита одним из признаков современного течения первичного сифилиса. Вместе с тем, сопутствующий лимфангит не был отмечен ни у одного из обследованных пациентов (0%). Анализ данных литературы показал существенное снижение частоты регистрации данного признака: с 30% - 18,6% в конце ХIХ века (Bassereau, 1895; Фурнье А., 1899) до 1,7% в начале ХХI века (О.Г.Калугина, 2003), что позволило расценить его отсутствие у наблюдавшихся нами пациентов как одну из особенностей современного течения первичного сифилиса. В результате проведенных исследований не отмечено каких-либо существенных отличий при сравнении клинических симптомов вторичного сифилиса с данными литературы прошлых лет. Вместе с тем, установлено существенное увеличение частоты встречаемости папулезных высыпаний на ладонях и подошвах (47,6%) в сравнении с данными авторов конца ХIХ века (Ге А., 1895 - 4,5-6%;), 70-х годов ХХ века: (Скрипкин Ю.К., 1975 – 22,1%; Антоньев А.А.,1978 - 20,7%), что коррелирует с данными, полученными О.Г.Калугиной (2003), А.В Вислобоковым. (2006). Отмечено увеличение частоты регистрации пустулезного сифилида (у 3,7% больных) в сравнении с данными авторов 60-70х годов ХХ века (Рахманов В.А., 1967- 2,4%; Абдулаев А.Х., 1972 - 0,572,1%; Антоньев А.А.,1978 - 1,3%). Выявлено значительное уменьшение частоты встречаемости сифилитической алопеции (у 13,4% больных) в сравнении с данными авторов конца ХIХ (Diday, 1895 – 90%) и отсутствие существенных изменений в частоте встречаемости лейкодермы (3,7% по результатам настоящего исследования; 4% - по данным Фурнье А.,1899; 2,1% - по данным Аковбяна В.А. , 2002). Таким образом, проведенные исследования позволили констатировать изменение клинического течения ранних манифестных форм сифилитической инфекции (первичного, вторичного сифилиса) в сравнении с данными дерматовенерологов конца ХIХ – первой половины ХХ века, что может быть расценено, как ее патоморфоз. 2.Диагностическая значимость полимеразной цепной реакции в сравнении с темнопольной микроскопией у больных с манифестными проявлениями при ранних формах сифилитической инфекции (первичный и вторичный сифилис). Для удобства сопоставления результатов исследования клинических образцов, полученных от больных сифилисом, на присутствие бледной трепонемы методами ТПМ и ПЦР все больные были разделены на четыре группы: А, B, C, D (таблица 1.) - 11 - Таблица 1.Результаты сравнительного изучения образцов клинического материала больных первичным и вторичным сифилисом методами ТПМ и PCR-tpp47 Группы Результаты обнаружения T.pallidum прямыми методами Больные первичным сифилисом Обнаружена методами ТПМ и PCR -tpp47 Обнаружена только методом PCR B tpp47 C Обнаружена только методом ТПМ D Не обнаружена обоими методами Общее количество обследованных методами ТПМ и PCR -tpp47 A Больные вторичным сифилисом Общее количество пациентов 13 42 55 4 24 28 2 0 3 13 5 13 19 82 101 Как следует из представленной таблицы, у 55 пациентов (группа А, больные первичным и вторичным сифилисом) возбудитель сифилиса обнаруживался как с помощью ТПМ, так и методом PCR-tpp47. У 13 пациентов (группа D, больные только вторичным сифилисом) бледная трепонема не обнаруживалась ни методом ТПМ, ни методом PCRtpp47. Таким образом, совпадающие результаты обоих методов прямого выявления бледной трепонемы (ТПМ и ПЦР) были получены у 68 (67%) обследованных пациентов. В обеих группах (А и D) результаты трепонемных и нетрепонемных серологических тестов были положительными. У 28 пациентов (больные первичным и вторичным сифилисом, группа В) в райцсеруме сифилидов методом PCR-tpp47 обнаруживалась ДНК бледной трепонемы, а темнопольная микроскопия давала отрицательный результат. У 5 больных (группа С: 2 больных с диагнозом первичного и 3 – вторичного сифилиса) бледная трепонема выявлялась методом темнопольной микроскопии, а ПЦР давала отрицательный результат. Таким образом, несовпадение результатов прямого выявления бледной трепонемы методами ТПМ и PCR-tpp47 было установлено у 33 пациентов (33%). Для выяснения причин расхождения результатов между PCR-tpp47 и ТПМ и подтверждения обнаружения бледной трепонемы в исследуемом клиническом материале у 33 пациентов (группы В и С) было проведено дополнительное исследование образцов на наличие 16S-рибосомального гена трепонем. Кроме этого, с целью видовой идентификации микроорганизма был проведен анализ нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов 16S-рибосомального гена методом секвенирования. Такой анализ в последние годы стал основным в создании современной таксономической - 12 - классификации микроорганизмов (Jill E.C., 2004). Полученные данные представлены в таблице 2. Таблица 2. Результаты проведения PCR-16SrDNA и секвенирования ДНК микроорганизмов в клинических образцах больных сифилисом с несовпадающими данными ТПМ и PCR-tpp47 Группа В Число образцов 28 PCR-tpp47 PCR-16SrDNA 28 Обнаружена Treponema C 2 0 Обнаружена Treponema C 3 0 Обнаружена Treponema Секвенирование Обнаружена T.pallidum Обнаружена T.putidum Обнаружена T.refringens Как следует из приведенных данных, во всех клинических образцах, полученных от 28 больных сифилисом, у которых бледная трепонема не обнаруживалась методом темнопольной микроскопии, но выявлялась ДНК бледной трепонемы методом PCR-tpp47 (группа В), было подтверждено наличие ДНК микроорганизмов рода Treponemа. Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК обнаруженного микроорганизма, проведенный методом секвенирования, подтвердил его принадлежность к виду T.pallidum. Возможной причиной расхождения результатов исследования образцов рейц-серума. сифилидов от этих пациентов методами ТПМ и аналитическую чувствительность PCR-tpp47 следует считать более высокую метода ПЦР, а также влияние на результаты ТПМ приема системных и местных антибактериальных и антисептических препаратов, снижающих эффективность обнаружения бледной трепонемы, наличие сопутствующей инфекции (в особенности герпетической). Во всех 5-ти образцах пациентов группы С, у которых метод ТПМ давал положительный результат, а результаты ПЦР-исследования оказались отрицательными, методом PCR-16S-rDNA было подтверждено наличие в клиническом материале трепонем. Вместе с тем метод секвенирования позволил отнести эти трепонемы к другим видам: T.putidum (у 2-х пациентов) и T.refringens (у 3-х обследованных), что говорило о возможности ошибок диагностики, допущенных врачами лабораторий при проведении темнопольной микроскопии. Эта группа была представлена двумя пациентами с диагнозом первичного сифилиса и тремя пациентами с диагнозом вторичного сифилиса. При этом, если у вторичным сифилисом клинические данные серологического обследования на сифилис, то у подтверждались больных результатами пациентов с первичным сифилисом результаты как трепонемных, так и нетрепонемных серологических тестов были - 13 - отрицательными, а диагноз был установлен только на основании клинических данных и положительных результатов ТПМ. Данные ПЦР и последующего секвенирования выделенных ДНК возбудителя подтвердили наличие в клинических образцах этих пациентов Treponema refringens, а не T.pallidum. Кроме того, именно у этих двух пациентов из всех обследованных лиц в материале соскобов с высыпаний на коже была обнаружена ДНК вируса простого герпеса 2-го типа. Возможно, на фоне клинической картины, характерной для сифилиса, мнение специалиста, проводившего микроскопию, о видовой принадлежности наблюдаемых спирохет склонилось в пользу T.pallidum, в то время как причиной эрозивно-язвенных поражений гениталий являлся ВПГ-2. Полученные результаты позволяют считать, что этим пациентам с эрозивно-язвенными проявлениями, вызванными ВПГ-2 и колонизированными сапрофитными трепонемами, на основе результатов ТПМ диагноз первичного сифилиса был поставлен ошибочно, т.е. имела место гипердиагностика первичного сифилиса методом ТПМ. С учетом результатов исследования окончательная оценка диагностической значимости полимеразной цепной реакции в сравнении с темнопольной микроскопией у больных с манифестными проявлениями при ранних формах сифилитической инфекции осуществлялась на 99 больных сифилисом. При этом чувствительность ПЦР у больных первичным сифилисом составила 100%±0% (чувствительность темнопольной микроскопии – 76,5±10,6%, р<0,05), при вторичном сифилисе - 80,5±4,4% (темнопольной микроскопии – 51,2±5,6%, р<0,001). Общая чувствительность метода ПЦР при диагностике первичного и вторичного и вторичного сифилиса составила 83,8±3,7% (темнопольной микроскопии – 55,6±3,0%, р<0,001). Общее количество случаев гипердиагностики методом ТПМ составило 5% (5человек из 101). Изучение специфичности метода ПЦР при диагностике сифилиса, проведенное на 118 пациентах группы контроля, позволило подтвердить высокую специфичность метода. При этом результаты ПЦР оказались отрицательными у 116 пациентов и положительными – у 2-х женщин, у которых клинический материал был получен из цервикального канала и на момент обследования отсутствовали клинические проявления сифилиса. При динамическом наблюдении за данными пациентками была отмечена позитивация серологических реакций на сифилис и развились клинические признаки сифилиса. Возможно, в момент обследования клинические проявления инфекции у этих пациенток локализовались в области шейки матки и не были замечены при обследовании. Проведенные исследования позволили расценить специфичность метода ПЦР при обследовании на сифилис, как 100%. - 14 - Таким образом, проведенное исследование показало, что результаты метода ПЦР при обследовании лиц с подозрением на сифилис позволяют более объективно по сравнению с микроскопическим методом оценивать как наличие, так и отсутствие возбудителя в исследуемом материале, обеспечивая точность поставленного диагноза. Широкая оснащенность современных диагностических лабораторий оборудованием для проведения ПЦР-исследований и наличие зарегистрированных коммерческих диагностикумов позволяют ставить вопрос о целесообразности включения данного метода в алгоритм лабораторного обследования лиц с подозрением на первичный и вторичный сифилис. В связи с этим следует считать целесообразным применять метод ПЦР при подозрении на первичный и вторичный сифилис, в особенности при отрицательных данных ТПМ, приеме системных и местных антибактериальных и антисептических препаратов, наличии микст-инфекции (в особенности герпетической). 3. Эффективность метода иммуноблоттинга при диагностике ранних форм сифилиса и у лиц, находившихся в половом контакте с больными сифилисом. При обследовании больных первичным сифилисом стандартными серологическими методами наименее чувствительной оказалась РСК с кардиолипиновым антигеном (положительный результат получен в 65±7,6% случаев) (таблица 3.). Таблица 3. Чувствительность стандартных серологических методов и иммуноблоттинга на ранних стадиях сифилитической инфекции (M±m, %) Группы пациентов Cифилис первичный (n=46) Сифилис вторичный (n=25) Сифилис скрытый ранний (n=25) ЛБПК (n=14) РМП РСКт РСКк РИФабс РПГА ИФА ИБ 88,6±4,9 87,5±5,3 39/44 35/40 65±7,6 26/40 100 40/40 97,4±2,6 37/38 97,7±2,3 42/43 100 46/46 100 25/25 100 25/25 100 25/25 100 25/25 100 25/25 100 25/25 96,0±4,0 24/25 96,0±4,0 24/25 96,0±4,0 24/25 100 25/25 0 0 21±11,3 3/14 36±13,3 5/14 100 25/25 92,0±5,5 96,0±4,0 92,0±5,5 23/25 24/25 23/25 7±7,1 1/14 0 0 Несколько более чувствительными оказались другие реакции комплекса серологических реакций: РСКт (87,5±5,3%) и РМП (88,6±4,9%). Наиболее чувствительными из серологических тестов оказались трепонемные тесты: РИФабс – 100% и ИФА 97,7±2,3 %. РПГА давала положительный результат в 97,4±2,6%. Чувствительность иммуноблоттинга - 15 - при первичном сифилисе первоначально была определена, как 97,8 %. При этом у 1 пациента с отрицательным результатом ИБ был выявлен факт неправильного хранения материала пред исследованием, что не исключало возможности получения ложноотрицательного ответа. При повторном обследовании больного с исследованием новой порции крови был получен положительный результат ИБ, что позволило сделать вывод о 100% чувствительности метода ИБ. Положительные результаты иммуноблоттинга регистрировались у ряда пациентов с первичным сифилисом при отрицательных результатах РСКк, РМП или РСКт, а также ИФА и РПГА. При этом чувствительность метода иммуноблоттинга достоверно превышала чувствительность РСКк (р<0,001), РМП (р<0,05) и РСКт (р<0,05). Таким образом, проведенные исследования позволили сделать заключение о 100% чувствительности метода ИБ у больных первичным сифилисом, превышающей чувствительность нетрепонемных (РСКк,; РМП) и трепонемных (кроме РИФабс) тестов. У больных вторичным сифилисом результаты всех серологических методов (РСК, РМП, РПГА, РИФабс, ИФА, а также иммуноблоттинга оказались положительными (100% чувствительность), что соответствовало современным представлениям о развитии на вторичной стадии сифилитической инфекции максимального иммунного ответа организма больных к T. pallidum и свидетельствовало о нецелесообразности использовать метод иммуноблоттинга для диагностики этой стадии инфекции, т.к. при вторичном сифилисе положительный результат регистрируется При скрытом раннем сифилисе чувствительность РМП и РСКк составила 92,0±5,5%, РСКт -96,0±4,0 %. Чувствительность РПГА, РИФабс и ИФА составила 96,0±4,0%. При обследовании больных скрытым ранним сифилисом методом иммуноблоттинга положительные результаты были получены у всех пациентов (100% чувствительность). При этом положительные результаты иммуноблоттинга регистрировались у двух больных скрытым ранним сифилисом с разноречивыми данными классических серологических методов (РСКк и РМП – отрицательные, РСКт – положительная в низком титре), когда требовалось результатами проведение стандартных дифференциальной серологических диагностики реакций. с Таким ложноположительными образом, проведенные исследования позволили сделать заключение о 100% чувствительности метода ИБ у больных скрытым ранним сифилисом, превышающей чувствительность стандартных нетрепонемных и трепонемных тестов. При обследовании лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом, положительный результат в иммуноблоте был получен у 36 % пациентов (5 человек). Кроме ИБ, положительный результат был выявлен также в РМП (7% - 1 чел.) и ИФА (21% - 3 - 16 - чел.), в то время как другие реакции (РСКТ, РСКК отрицательными. РИФабс и РПГА) оказались Таким образом, иммуноблоттинг оказался наиболее чувствительной реакцией, позволяющей устанавливать инфицированность у лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом. При тестировании сывороток крови лиц без указаний на наличие сифилитической инфекции (100) все 50 сывороток крови от больных кожными заболеваниями и 48 сывороток крови, взятых от доноров крови, показали отрицательные результаты. У двух доноров были зарегистрированы положительные результаты имуноблоттинга с невысокими уровнями позитивности реакции с отдельными рекомбинантными белками (на уровне 1-2+). Последующее обследование этих пациентов с помощью иммуноблоттинга и других специфических реакций (ИФА, РИФабс), проведенное через 2 недели после первого обследования, позволило установить ложный характер серопозитивности. Таким образом, специфичность линейного иммуноблоттинга при использовании диагностикума «INNOLiaTM Syphilis Score» составила 98%. Метод иммуноблоттинга позволяет не только проводить диагностику сифилиса по суммарному результату реакции, но и, при необходимости, давать оценку вклада каждого из рекомбинантных белков диагностикума и образования к ним антител в формирование общего результата реакции. 4 3,5 3 TpN47 TpN17 TpN15 TmpA 2,5 2 1,5 1 0,5 0 ЛБПК Сифилис первичный Сифилис вторичный Сифилис ранний скрытый Примечание: по оси абсцисс - стадии сифилиса; по оси ординат – условные единицы измерения (по системе четырех «крестов»). Рисунок 2. Средний уровень антителообразования к рекомбинантным белкам T.pallidum у больных сифилисом. - 17 - Проведенные исследования показали (рисунок 2), что антитела к отдельным рекомбинантным белкам Treponema pallidum (TpN17, TpN47, TpN15) регистрировались на самых ранних стадиях инфекции, начиная с периода инкубации (лица, контактные по сифилису, получающие превентивное лечение). У этих пациентов максимальным было антителообразование по отношению к TpN17 (при количественном учете реакции по системе четырех «крестов» - на уровне 1,4 ± 0,01), однако образование антител по отношению к другим рекомбинантным антигенам бледной трепонемы (TpN47, TpN15, TmpA) было незначительным (к TpN47 - 0,9±0,01; к TpN15 – 0,8±0,005; к TmpA - 0,8±0,06), что не позволило регистрировать положительный результат реакции у всех пациентов. При первичном сифилисе отмечалось значительное (но не максимальное – в сравнении с вторичным сифилисом) усиление антителообразования по отношению ко всем используемым в ИБ антигенам (максимально - по отношению к TpN17: 2,9±0,01; к TpN47: 2,7±0,01; к TpN15: 2,2±0,15, минимально – к TmpA – 1,7±0,03), что сопровождалось возрастанием числа положительных результатов иммуноблоттинга до 100% за счет суммарного учета реакции на все рекомбинантные антигены. В период «разгара» инфекции (вторичный, скрытый ранний сифилис) интенсивность антителообразования являлась максимальной и проявлялась в иммуноблоте по отношению ко всем четырем рекомбинантным антигенам Treponema pallidum (при вторичном сифилисе – к TpN17 - 3,8±0,003; к TpN47 - 3,7±0,005; к TpN15 - 3,8±0,003; к TmpA - 3,1±0,005 ; при скрытом раннем сифилисе: к TpN17 - 3,8±0,007; к TpN47 - 3,3±0,003; к TpN15 - 3,3±0,007; к TmpA - 3,3±0,007), что обеспечивало 100% чувствительность реакции. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что метод иммуноблоттинга может быть удобным инструментом для ранней диагностики сифилиса. Следует отметить высокую диагностическую эффективность иммуноблоттинга в возможном инкубационном периоде (что выявляется при обследовании лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом) и при первичном сифилисе, а также в сложных диагностических ситуациях, когда этот метод может выполнять функции референс-метода, что особенно важно в плане возможной замены данным методом таких высокоспецифичных, но требующих наличия вивария и достаточно субъективных методов, как РИФ и, в особенности, РИТ. Учитывая изложенное, следует считать целесообразным применение метода иммуноблоттинга на ранних стадиях инфекции при обследовании лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом; при обследовании пациентов с подозрением на первичный сифилис в случае отрицательных результатов стандартных серологических реакций (РМП, РСК) и высоком риске заражения сифилисом; для подтверждения диагноза сифилиса скрытого раннего при противоречивых результатах классических серологических методов и необходимости - 18 - проведения дифференциальной диагностики с ложноположительными результатами серологических реакций на сифилис Выводы: 1.В результате проведенных исследований установлены особенности современного клинического течения ранних манифестных форм сифилитической инфекции в сравнении с данными дерматовенерологов конца ХIХ – первой половины ХХ века, которые заключаются в значительной частоте регистрации язвенных, множественных и осложненных твердых шанкров и отсутствии специфического лимфангита у больных первичным сифилисом и в увеличении частоты встречаемости папулезных высыпаний на ладонях и подошвах, значительной частоте регистрации пустулезных сифилидов, уменьшении частоты встречаемости специфической алопеции у больных вторичным сифилисом. 2. В результате сравнительного изучения диагностической эффективности ПЦР и темнопольной микроскопии при исследовании райц-серума сифилидов больных первичным и вторичным сифилисом установлена более высокая чувствительность метода ПЦР с использованием в качестве мишени гена tpp47 T.pallidum (диагностикум «Амплисенс Treponema pallidum»): при первичном сифилисе чувствительность ПЦР составила 100%, ТПМ – 76,5%, р<0,05; при вторичном сифилисе чувствительность ПЦР составила 80,5%, ТПМ – 51,2% , р<0,001). Специфичность ПЦР составила 100%. 3.При обследовании больных ранними формами сифилиса методом иммуноблоттинга и стандартными серологическими методами (РМП, РСК, ИФА, РПГА, РИФабс) выявлена высокая чувствительность линейного иммуноблоттинга (диагностикум «INNO-LiaTM Syphilis Score») при диагностике первичного (чувствительность 100%), вторичного (чувствительность 100%), скрытого раннего (чувствительность 100%) сифилиса, обследовании лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом (чувствительность – 36%), превышавшая чувствительность стандартных нетрепонемных и трепонемных тестов (кроме РИФабс) при первичном сифилисе и чувствительность нетрепонемных и трепонемных тестов при скрытом раннем сифилисе. Специфичность метода составила 98%. 4.Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать применение ПЦР и иммуноблоттинга на ранних стадиях сифилитической инфекции в качестве дополнения к общепринятым методам диагностики в следующих клинических ситуациях: Метод ПЦР - при подозрении на первичный и вторичный сифилис, в особенности при отрицательных данных ТПМ, приеме системных и местных антибактериальных и антисептических препаратов, наличии микст-инфекции (в особенности герпетической). Метод иммуноблоттинга - на ранних стадиях инфекции при обследовании лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом; при обследовании пациентов с подозрением на - 19 - первичный сифилис при отрицательных результатах стандартных серологических реакций (РМП, РСК) и высоком риске заражения сифилисом; для подтверждения диагноза сифилиса скрытого раннего при противоречивых результатах классических серологических методов и необходимости проведения дифференциальной результатами серологических реакций на сифилис. - 20 - диагностики с ложноположительными Список работ, опубликованных по теме диссертации. 1. Гущин А.Е. Выявление ДНК и РНК Tp. pallidum в плазме крови при различных стадиях сифилиса / Гущин А.Е., Родионова Е.Н., Шипулин Г.А., Топоровский Л.М., Николенко Ю.А., Дударева Л.А. // Вестник последипломного медицинского образования. – 2003. - №2. – С.53. 2. Родионова Е.Н. Выявление ДНК и РНК Tp. pallidum в клиническом материале у пациентов с различными стадиями сифилиса / Родионова Е.Н., Гущин А.Е., Шипулин Г.А., Хлудова Н.А., Топоровский Л.М., Николенко Ю.А., Тома В.С., Дударева Л.А., Покровский В.В. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2003. -№3. – С.43-50. 3. Гущин А.Е. Сифилис: проблемы диагностики и возможности молекулярно-биологических технологий / Гущин А.Е., Родионова Е.Н., Шипулин Г.А., Кубанова А.А., Фриго Н.В., Лосева О.К., Ротанов С.В., Топоровский Л.М., Дударева Л.А., Воронова Н.Ю., Петрова Г.А., Зорькина М.В. // Сборник трудов 5 Всероссийской Научно-практической Конференции: «Генодиагностика инфекционных болезней». Москва , 2004. - Т1. – С. 24-27. 4. Гущин А.Е. Возможности и перспективы метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике ранних форм сифилиса / Гущин А.Е., Баткаев Э.А., Топоровский Л.М., Чухриенко И.Ю., Дударева Л.А. // Вестник последипломного медицинского образования. – 2005. - №1. – С.65. 5. Дударева Л.А. Исследование эффективности метода иммуноблоттинга (тест-система линейного иммуноферментного анализа «Inno- Lia™ Syphilis Score») у больных первичным сифилисом и в период возможного инкубационного периода / Дударева Л.А. // Сборник «Частные вопросы дерматовенерологии» (материалы межрегиональной научно-практической конференции с международным участием). Саратов: изд-во Саратовского мед. ун-та, 2006. - С. 126-127. 6. Кубанова А.А. Опыт использования метода иммуноблоттинга для диагностики сифилиса / Кубанова А.А., Фриго Н.В., Ротанов С.В., Нестеренко В.Г., Ловенецкий А.Н., Дударева Л.А. // Вестник дерматологии и венерологии. – 2006. №2. – С. 4-11. 7. Фриго Н.В. Результаты изучения диагностической эффективности новой тест-системы линейного иммуноферментного анализа «Inno- Lia™ Syphilis Score» / Фриго Н.В., Ротанов С.В., Нестеренко В.Г., Ловенецкий А.Н., Дударева Л.А. // Клиническая лабораторная диагностика. – 2006. - №3. – С. 36-41. - 21 - 8. Фриго Н.В. Диагностическая эффективность иммуноблоттинга при обследовании больных первичным сифилисом и лиц, находящихся в возможном инкубационном периоде / Фриго Н.В., Ротанов С.В., Дударева Л.А., Иванов А.М. // Сборник тезисов «Первичная и вторичная профилактика социально-значимых заболеваний кожи и ИППП на современном этапе» III Международная конференция, Алматы, 2006. - С.218-220. - 22 - Формат 60х84 1/16, Усл. Печ. Лист 1,5 Подписано в печать 14.05.07 г. Тираж 100 экз. Заказ № 1605 Отпечатано в типографии «АллА Принт» Тел. (495) 621-86-07, факс (495) 621-70-09 www.allaprint.ru - 23 - - 24 -
