Федеральное государственное бюджетное учреждение высшего

Федеральное государственное бюджетное учреждение высшего профессионального
образования
«НОВОСИБИРСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
(НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ, НГУ)
На правах рукописи
Музыка Владимир Владимирович
ВЛИЯНИЕ ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ И ГИПОКСИИ НА
КЛЮЧЕВЫЕ БЕЛКИ АПОПТОЗА И ИХ РЕГУЛЯТОРЫ В
МОЗГЕ НЕОНАТАЛЬНЫХ КРЫС
03.03.01 – физиология
Диссертация
на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научный руководитель:
д.б.н., член-корр. РАН Дыгало Н. Н.
Новосибирск – 2014
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
4
Введение
5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Влияние глюкокортикоидов и гипоксии на
экспрессию ключевых белков каскада апоптоза и их регуляторов в
развивающемся головном мозге
9
1.1. Программируемая гибель клеток – апоптоз, и его молекулярные механизмы
9
1.1.1. Каспазы
10
1.1.2. Белки Bcl-2 семейства
12
1.1.3. Пути запуска апоптоза
15
1.2. Нейротрофины – регуляторы жизнеспособности и гибели нервных клеток
16
1.2.1. Экспрессия нейротрофинов и их рецепторов
18
1.2.2. Молекулярные механизмы действия нейротрофинов
24
1.2.3. Нейротрофины и апоптоз в онтогенезе ЦНС
27
1.3. Роль глюкокортикоидов в регуляции апоптоза в развивающейся HC
30
1.3.1. Рецеторы глюкокортикоидов
32
1.3.2. Механизмы действия глюкокортикоидов
35
1.3.3. Эффекты глюкокортикоидов в ЦНС
39
1.3.3.1. Влияние глюкокортикоидов на процессы апоптоза
1.4. Эффекты гипоксии на процессы апоптоза в развивающейся нервной системе
41
43
1.4.1. Молекулярные механизмы влияния гипоксии
44
1.4.2. Совместное влияние гипоксии и глюкокортикоидов на апоптоз в ЦНС
46
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
50
2.1. Животные и экспериментальные воздействия
50
2.1.1. Животные
50
2.1.2. Введение гормонов
50
2.1.3. Моделирование гипоксического состояния
51
2.2. Выделение образцов ткани мозга
52
2.3. Выделение РНК
53
2.4. Получение кДНК
53
3
2.5. Оценка уровней мРНК белка Bcl-XL методом полимеразной цепной реакции в
реальном времени (real-time PCR)
54
2.6. Выделение суммарного белка и его разделение посредством одномерного
денатурирующего гель-электрофореза
57
2.7. Оценка уровней mat-BDNF, pro-BDNF, Bcl-XL, Bax, прокаспазы-3, активной
каспазы-3 и GR методом полуколичественного иммуноблота
57
2.8. Реактивы
59
2.9. Статистическая обработка данных
59
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
60
3.1. Анализ взаимного сопряжения экспрессии белков апоптоза в гиппокампе и стволе
головного мозга 3-дневных крысят
60
3.2. Экспрессия форм BDNF в отделах мозга неонатальных крысят
63
3.2.А. 3-дневные животные
63
3.2.Б. 8-дневные животные
63
3.3. Влияние глюкокортикоидов на уровни форм BDNF и ключевых белков
апоптозного каскада – Bcl-XL, Bax, прокаспазы-3 и активной каспазы-3 – в отделах
мозга неонатальных крысят
67
3.3.А. 3-дневные животные
68
3.3.Б. 8-дневные животные
70
3.3.В. Анализ эффектов дексаметазона на уровень активной каспазы-3 в мозге
через 6, 24 и 120 ч после введения гормона
3.4. Эффекты гипоксии и дексаметазона на экспрессию GR в неонатальном мозге
75
76
3.5. Влияние гипоксии и дексаметазона на экспрессию ключевых белков апоптозного
каскада в отдех мозга неонатальных крысят
3.5.А. Эффекты гипоксии
81
81
3.5.Б. Эффекты дексаметазона на фоне предшествующей и последующей
гипоксии
83
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
91
ВЫВОДЫ
109
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
110
4
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
AIF – apoptosis inducing factor – фактор индукции апоптоза
AP-1 – activator protein-1 – белок-активатор-1
BAD – Bcl-2-associated agonist of cell death – Bcl-2-ассоциированный агонист гибели клеток
Bax – Bcl-2-associated x protein — Bcl-2-ассоциированный x белок
Bcl-2 – B-cell lymphoma protein-2 — белок B-клеточной лимфомы-2
Bcl-XL – Bcl-2 X-linked protein — Bcl-2 X-связанный белок
BDNF – brain-derived neurotrophic factor – мозговой нейротрофический фактор
BH домен – домен Bcl-2 гомологии
CAD – caspase-activated DNAse – каспазо-активируемая ДНКгидролаза
CaRF – Сalcium-responsive transcription factor – кальций-зависимый транскрипционный фактор
CREB – сAMP-responsive element binding protein – цАМФ-зависимый транскрипционный фактор
DISC – Death-inducing signaling complex – сигнальный комплекс, индуцирующий гибель клеток
Est-2 – Expression sequence tag-1/2 – фрагмент, необходимый для экспрессии последовательности-1/2
ERK – Extracellular signal-regulated kinase – киназа, регулируемая внеклеточным сигналом
HRE – hypoxia-responsive element – гипоксия-отвечающий элемент генома
11-β-HSD – 11-β-hydroxi steroid dehydrogenase – 11-β-гидроксистероид дегидрогеназа
HSP – heat-shock protein – белки теплового шока
GR – глюкокортикоидный рецептор
GRE – glucocorticoid-responsive element – гормон-отвечающий элемент генома
IAP – inhibitor of apoptosis protein – белок ингибитор апоптоза
JNK – Jun N-terminal kinase – Jun N-концевая киназа
MAPK – mitogen-activated protein kinase – митоген-активируемая протеин киназа
mat-BDNF – mature BDNF – зрелая форма мозгового нейротрофического фактора
MEK – MAPK/ERK kinase – MAPK/ERK киназа
MR – минералокортикоидный рецептор
NGF – nerve growth factor – фактор роста нервов
NF-κβ – nuclear factor-κβ – ядерный фактор-κβ
NRIF – neurotrophin receptor interacting factor – фактор, взаимодействующий с рецептором
нейротрофинов
p75NTR – p75-нейротрофиновый рецептор
PI3K – фосфатидил-инозитол-3 киназа
PLC – фосфолипаза С
RIP – regulated intermembrane proteolysis – регулируемый внутримембранный протеолиз
ROS – reactive oxygen species – активные формы кислорода
TM домен – трансмембранный домен
TNF – tumor necrosis factor – фактор некроза опухолей
TrkB – tropomyosin-related kinase B – киназа B, родственная тропомиозину
USF-1/2 - upstream stimulatory factor-1/2 – вышележащий фактор стимуляции 1/2
VDAC – voltage-dependent anion channel – потенциал-зависимый анионный канал
VEGF – vascular endothelial growth factor – фактор роста эндотелия сосудов
АКТГ – адренокортикотропный гормон
ГАМК – гамма-амино-масляная кислота
ГГНС – гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система
ПКГ – программируемая клеточная гибель
РДС – респираторный дистресс-синдром
5
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. В ходе онтогенеза в центральной нервной системе
млекопитающих закладывается избыточное число нервных клеток, которые затем
избирательно элиминируются в ходе формирования дефинитивной структуры мозга
(Oppenheim, 1991; Ikonomidou, 2009). Процессы элиминации невостребованных
клеток крайне чувствительны к внутренним для организма и средовым факторам,
которые способны сдвигать равновесие между пролиферацией и гибелью клеток в ту
или иную сторону, что позволяет формируемым в онтогенезе структурам
адаптироваться для выполнения своих функций в зависимости от пола, возраста и
условий среды (Kim et al., 2011).
Важнейшим путем элиминации избыточных клеток является апоптоз – основной
тип программируемой клеточной гибели в развивающемся мозге. За вступление
клетки в апоптоз ответственен баланс белков Bcl-2 семейства (Hagberg et al., 2009).
Ключевыми регуляторами апоптозного каскада в ЦНС являются проапоптозный белок
Bax и антиапоптозный Bcl-XL. Перевес экспрессии проапоптозных белков приводит к
высвобождению из митохондрий специфических факторов, необходимых для
активации основной эффекторной протеазы апоптоза – каспазы-3. Её действие на свои
многочисленные субстраты приводит к реализации конечных эффектов программы
клеточной гибели (Troy et al., 2011).
Баланс Bcl-2 белков, в свою очередь, определяется множеством аспектов,
важнейшим из которых является влияние трофических факторов нейротрофинов
(Renton, Xu et al. 2010). В развивающемся мозге ключевым нейротрофином является
мозговой нейротрофический фактор – BDNF (Friedman, 2010). Реализуя своё действие
преимущественно через TrkB рецепторы, BDNF способствуют выживанию клеток. В
то же время незрелая форма белка – pro-BDNF, связываясь с рецептором p75NTR,
оказывает проапоптозное действие (Willnow et al., 2008; Bernd, 2008).
Другими важнейшими факторами, потенциально способными влиять на
экспрессию белков программы апоптоза клеток центральной нервной системы,
являются гормоны, действие которых в наибольшей степени проявляется в
6
критические периоды развития, когда мозг наиболее чувствителен к действию стресса.
Ключевую
роль
в
реализации
стрессорного
ответа
организма
играют
глюкокортикоиды (Sapolsky et al., 2000; Sapolsky, 2003). Индуцируемое стрессом
повышение уровня этих гормонов в крови в раннем онтогенезе может необратимо
влиять
на
морфологию
головного
мозга,
и
приводить
к
последующим
долговременным изменениям поведения и психической сферы (Dumas et al., 2009). В
некоторых случаях глюкокортикоиды способны оказывать и противоположное,
нейропротективное действие (Tuor, Yager et al. 1997). Имеющиеся в литературе
данные, свидетельствующие о критически важных событиях в формировании мозга в
неонатальный период онтогенеза, оставляют, однако открытыми вопросы как о самом
действии глюкокортикоидов на апоптоз, так и о способности этих гормонов изменять
экспрессию белков апоптозного каскада и их регуляторов в формирующемся
головном мозге. Получение ответов эти вопросы представляется важным, поскольку
глюкокортикоиды и их синтетические аналоги используются в перинатальной
медицине,
и,
кроме
того,
эти
гормоны
способны
опосредовать
действие
разнообразных стрессоров на развивающийся организм.
Глюкокортикоиды применяют для коррекции патологических состояний
новорожденных, связанных с недоразвитием лёгких и последующей асфиксией (Jobe
et al., 2009), однако гипоксия, как и гормоны стресса, способна оказывать негативное
влияние на развивающийся мозг (Sapolsky, Romero et al. 2000; Morrison et al., 2013). В
зависимости от врачебных показаний, гормональную терапию назначают как до
родов, сопровождаемых гипоксией, так и после рождения. Эффекты указанных
воздействий в мозге зачастую различны в зависимости от порядка приложения
факторов (Jobe et al., 2009; Zualoga et al., 2012), но несмотря на всю важность
последствий двух процедур, непосредственное сравнение различий в их эффектах на
экспрессию белков, отвечающих за жизнеспособность клеток формирующегося мозга,
до сих пор не проведено. В этой связи, критически важным представляется прямое
сопоставление последствий действия гипоксии и глюкокортикоидов на экспрессию
белков апоптоза и их регуляторов в развивающемся мозге в зависимости от порядка
приложения данных воздействий.
7
Цели и задачи исследования. Основной целью нашей работы стало выяснение
влияний глюкокортикоидов и гипоксии и их сочетанного действия на экспрессию
белков апоптозного каскада в отделах мозга неонатальных крысят. Для достижения
этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить особенности экспрессии ключевых белков апоптозного каскада и форм
BDNF в отделах мозга неонатальных крыс;
2. Исследовать эффекты глюкокортикоидов на экспрессию ключевых белков
апоптозного каскада и форм BDNF в отделах мозга неонатальных крыс;
3. Исследовать эффекты совместного действия гипоксии и синтетического аналога
гормонов стресса – дексаметазона – на экспрессию ключевых белков
апоптозного каскада в отделах мозга неонатальных крыс.
Научная новизна. В работе впервые выявлена взаимосвязь экспрессии ключевых
белков апоптозного каскада в гиппокампе неонатальных животных, и отсутствие
подобной сопряженности в стволе мозга. Также впервые установлена обратная
зависимость между отношением mat-BDNF/pro-BDNF и экспрессией активной
каспазы-3 в отделах мозга неонатальных животных на 8-ой день жизни.
Впервые установлен антиапоптозный эффект гидрокортизона на экспрессию
ключевых белков апоптоза и форм BDNF в гиппокампе неонатальных животных.
Впервые обнаружено наличие отложенного повышения уровня активной каспазы-3 в
коре мозга неонатальных животных под действием дексаметазона через 120 часов
после введения гормона.
Впервые обнаружены эффекты совместного действия гипоксии и дексаметазона
на уровни белков апоптоза в стволовой части мозга неонатальных животных.
Выявлено, что уровень белка Bcl-XL снижается при введении дексаметазона после
гипоксии, но факторы по отдельности не изменяют уровни белка, при этом как по
отдельности, так и вместе стимулируя экспрессию мРНК Bcl-XL. Впервые показано,
что постгипоксическое применение дексаметазона обладает проапоптозным эффектом
на экспрессию белка Bcl-XL и отношение Bcl-XL/Bax в стволе развивающегося мозга.
8
Теоретическая и практическая значимость. Результаты работы расширяют
теоретические представления о влиянии гормонов стресса и гипоксии на экспрессию
белков, определяющих жизнеспособность клеток развивающегшося мозга. Кроме
того, полученные данные могут иметь важное практическое значение для
перинатальной медицины, поскольку они впервые позволяют оценить и сравнить
эффекты пред- и постгипоксического применения синтетических глюкокортикоидов
на экспрессию белков, регулирующих процессы выживания и гибели клеток
развивающегшося мозга.
Положения, выносимые на защиту:
1. Естественный глюкокортикоид гидрокортизон, связывающийся с глюко- и
минералокортикодными
рецепторами,
способен
приводить
к
антиапоптозным
изменениям уровней белков апоптозного каскада в гиппокампе неонатальных
животных. Этот гормон повышает уровень антиапоптозного белка Bcl-XL и снижает
уровни проапоптозных pro-BDNF, прокаспазы-3 и активной каспазы-3 через 6 часов
после его введения.
2. Гипоксия в неонатальный период развития вызывает антиапоптозные изменения
уровней белков программируемой гибели клеток в стволе головного мозга. В
условиях гипоксии в этом отделе мозга через 6 часов повышается экспрессия мРНК
антиапоптозного Bcl-XL, а через 22 часа снижается уровень исполнительной протеазы
апоптоза активной каспазы-3.
3. Имеется взаимодействие гипоксии и синтетического активатора GR дексаметазона
в регуляции экспрессии глюкокортикоидного рецептора (GR) и антиапоптозного
белка Bcl-XL в формирующемся головном мозге – последствия совместного влияния
этих факторов не являлись суммой их самостоятельных эффектов и зависели от
последовательности их действия. Постгипоксическое применение дексаметазона, в
отличие от предгипоксического, приводит к проапоптозным сдвигам уровней
ключевых белков каскада апоптоза.
9
Апробация работы. Материалы данной работы были доложены и представлены на
XLVII и XLVIII Международных научных студенческих конференциях (Новосибирск,
2009, 2010); XXI Съезде физиологического Общества им. И.П. Павлова (Калуга,
2010); 5-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным
участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов»
(Новосибирск, 2011); VII Сибирском физиологическом съезде (Красноярск, 2012);
XXII Съезде Физиологического общества им И.П. Павлова (Волгоград, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, в их числе 3 статьи в
рекомендованной в списке ВАК отечественной рецензируемой печати.
10
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Влияние глюкокортикоидов и гипоксии на
экспрессию ключевых белков каскада апоптоза и их регуляторов в
развивающемся головном мозге
1.1. Программируемая гибель клеток – апоптоз, и его молекулярные механизмы
Гибель избыточных клеток абсолютно необходима для создания и поддержания
необходимого клеточного состава и пространственной структуры ткани (Schwartzman
and Cidlowski, 1993). Он позволяет закладываемым в онтогенезе структурам
приобретать значительную пластичность и адаптироваться для выполнения своих
функций в зависимости от пола, возраста и условий среды (Meier et al., 2000). Впервые
гибель клеток в ходе онтогенеза описана около века назад и была тогда принята за
процесс устранения поврежденных клеток в эмбрионах. Для многоклеточных
организмов
важно
своевременное
избавление
от
поврежденных
и
иных
нежелательных клеток как в ходе развития, так и во взрослом состоянии (Antonsson,
2004).
Первые
документальные
подтверждения
физиологической
элиминации
избыточных клеток были получены в исследованиях на C. elegans (Horvitz, 1999).
Удаление избыточных клеток в течение периода их физиологической гибели
критично для формирования в онтогенезе нервной системы позвоночных (Oppenheim
1991; Meier, Finch et al. 2000). Выживают на этой стадии развития те нейроны,
которые формируют синаптические связи с клетками-мишенями, соревнуясь при этом
за ограниченный запас трофических факторов, секретируемых этими клетками (Barde,
1989). Гибель клеток в развивающейся нервной системе была обнаружена около века
назад, а примерно 80 лет назад было выдвинуто предположение о её потенциальной
значимости
для
нормального
морфогенеза
мозга
(Hamburger,
1992).
Стоит
подчеркнуть, что хотя зрелые нейроны являются одними из самых долго живущих
клеток, незрелые нейроны гибнут в огромных количествах в ходе развития индивида.
Гибель зрелых нейронов наблюдается при патологиях: при острых и при хронических
нейродегенеративных заболеваниях (Yuan and Yankner, 2000).
Основополагающие наблюдения, сделанные около сорока лет назад Wylie и Kerr,
позволили им определить основные морфологические черты клеток, в которых
11
активирован процесс гибели, не имеющий характерных признаков некроза. Такой
процесс был назван авторами апоптозом (Kerr et al., 1972). Анализ данного процесса с
помощью электронной и световой микроскопии выявил сморщивание клеток и сжатие
их ядер (пикнозис), фрагментацию ядер и конденсацию хроматина с последующим
формированием апоптотических тел – окруженных мембраной образований, которые
затем
подвергаются
фагоцитозу.
Несмотря
на
то,
что
не
каждый
тип
программируемой гибели клеток является в чистом виде апоптозом, большинство
клеток, гибнущих по естественным причинам имеют представленные выше критерии
этого биологического процесса (Kroemer and Martin, 2005). В основе морфологических
изменений
при
программируемой
клеточной
гибели
лежат
определенные
молекулярно-биологические механизмы. Существует два основных пути реализации
апоптоза:
рецептор-опосредованный
(митохондриальный),
в
нервной
(рецепторный)
системе
значительный
и
внутриклеточный
вклад
даёт
именно
внутриклеточный механизм запуска гибели клеток (Thornton et al., 2012). Оба пути
высоко консервативны в эволюции многоклеточных организмов и для их протекания
необходим запуск внутриклеточных каскадов с участием белков, синтезируемых для
этого клеткой (Hengartner, 2000).
1.1.1. Каспазы
Каспазы - цистеиновые протеазы, гидролизующие пептидную цепь по
аспарагиновой кислоте (Thornberry, 1999). У человека имеется 11 каспаз, у грызунов –
13 (Degterev et al., 2003). Некоторые из них, каспазы-1, -4 и -5, вовлечены в
воспалительные процессы (Kroemer and Martin, 2005), однако большинство белков
данного семейства являются ферментами апоптозного каскада. Молекула прокаспазы
содержит
в
своей
структуре
сигнальный
аминотерминальный
продомен,
принимающий сигналы от вышестоящих членов каскада, и основную часть. Эта часть
в результате протеолитического расщепления на продомен, большую и малую
субъединицы и последующего объединения двух больших и двух малых субъединиц
образует активную форму фермента (Degterev et al., 2003). Каспазы активируются
трёмя путями: за счет расщепления профермента аутолитическим путем; протеолизом,
12
осуществляемым
апоптосомный
инициаторной
комплекс,
каспазой;
который
или
содержит
в
результате
факторы,
вовлечения
высвобождаемые
в
из
межмембранного пространства митохондрий (Hengartner, 2000). Активация каспаз не
приводит к массированной деградации клеточных белков. У этих ферментов узкий
спектр белков-мишеней (Hengartner, 2000). По строению продоменов каспазы
подразделяют на две функциональные группы. Первая группа – инициаторные
каспазы имеют длинный сигнальный домен, состоящий из более чем 10
аминокислотных остатков. Такие белки (каспазы-2, -8, -9 и -10), как правило,
передают апоптозный сигнал от верхних уровней, в частности, от рецепторов, к
эффекторным звеньям каскада. Ко второй группе относят каспазы-3, -6, -7 с коротким
продоменом - менее 10 аминокислотных остатков. Они обычно и являются основными
исполнителями процесса апоптоза (Yuan and Yankner, 2000).
Активация каспазы-3 является ранним маркером апоптоза (Machaalani and
Waters, 2003). Неоднократно показано, что процесс апоптоза, в большинстве случаев,
неразрывно связан с уровнем активации каспазы-3 (Wang, Wu et al. 2005). Ген
каспазы-3 находится в 4 хромосоме у человека и в 16 хромосоме у крысы (Earnshaw et
al., 1999). В промоторе гена отсутствует TATA-box, но содержится кластер SP1
элементов, а также множественные сайты инициации транскрипции (Liu, Wang et al.
2002). Прокаспаза-3 имеет молекулярный вес 32 КДа (177 аминокислот), при её
активации образуются две субъединицы с молекулярным весом 12 и 17 Кда (Degterev
et al., 2003). Большинство видимых эффектов апоптоза обусловлено действием
каспазы-3, предпочтительно гидролизующей белки-мишени по карбоксиконцевой
позиции мотива DEXD (Degterev et al., 2003). Субстратами каспазы-3 являются
структурные компоненты клетки, такие как актин и ламинин ядерной оболочки,
ингибиторы ДНКаз, такие как ICAD (Shi, 2002), а также белки, активируемые каспаззависимым протеолизом, в числе которых ДНКгидролаза (СAD). Этот фермент
гидролизует ДНК по межнуклеосомным сайтам на фрагменты, длиной 180-200 пар
нуклеотидов, выявляемые гель-электрофорезом ДНК в виде характерного признака
апоптоза – «нуклеосомной лестницы» (Hengartner, 2000). На ключевую роль
исполнительных каспаз и каспазы-3 в их числе в осуществлении апоптоза указывает
13
предотвращение фрагментации ДНК, пикнозиса и формирования апоптотических
телец
ингибиторами
этих
протеаз
(Kroemer,
Martin,
2005).
Естественными
ингибиторами каспазы-3 являются IAP (Inhibitors of Apoptosis Proteins) (Hengartner,
2000).
1.1.2. Белки Bcl-2 семейства
Основными регуляторами митохондриального пути апоптоза являются белки
Bcl-2 семейства. Оно состоит как минимум из 22 членов и включает белки как с про-,
так и с антиапоптозной активностью (Antonsson, 2004). Взаимодействие Bcl-2 белков
друг с другом предопределяет высвобождение факторов апоптоза из митохондрий
(Roset et al., 2007). Общей чертой этих белков является наличие консервативных
районов, названных Bcl-2 подобными (BH, Н-homology) доменами (van Delft and
Huang, 2006), которые присутствуют в каждом белке семейства в числе одной и более
копий (Roset et al., 2007). Некоторые из этих доменов участвуют во взаимодействии
между белками семейства (Antonsson, 2004) и в формировании их гомоолигомеров и
гетеродимеров. Последние формируются с участием про- и антиапоптозного белков
семейства (Hacker and Weber, 2007).
Белки с антиапоптозной активностью Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1 и A-1 содержат
по четыре BH-домена (BH1-BH4) (van Delft and Huang, 2006) . Аминокислотные
последовательности членов проапоптотозного подсемейства белков Bax-типа (Bax,
Вak, Bcl-XS и Bok) сходны с таковыми у антиапоптозных Bcl-2 белков, в особенности
в областях ВН(1, 2 и 4) доменов. Короткий BH3 мотив необходим для индукции
программируемой гибели клеток (van Delft and Huang 2006; Hacker and Weber 2007).
Этот домен белка также участвует в связывании с собственным трансмембранным
(ТМ) доменом, в результате которого белок лишается возможности встраиваться в
мембрану и остается в цитозоле. При взаимодействии с так называемыми “BH-3 only”
белками – проапоптозными членами Bcl-2 семейства, содержащими в своем составе
только BH3-домен, конформация проапоптозного Bcl-2 белка изменяется, его ТМдомен освобождается от собственного BH3-домена и белок транслоцируется во
14
внешнюю мембрану митохондрии, что приводит к дальнейшей реализации программы
апоптоза (Nechushtan et al., 1999).
На уровне межбелковых взаимодействий процесс запуска апоптозного каскада
выглядит так: проапоптозные факторы “BH-3 only” подсемейства, такие как Bim, Bid,
BAD и Puma, служат проводниками апоптозного сигнала, активируя белки
мультидоменного подсемейства Bcl-2 белков – Bax и Bak (Green and Kroemer 2004;
Herold, McPherson et al. 2006); этому процессу противостоят Bcl-2 белки
антиапоптозного подсемейства, такие как Bcl-2 и Bcl-XL, связывающие и
нейтрализующие Bax и Bak (Adams, Huang et al. 2005). Bax и Bak формируют поры во
внешней митохондриальной мембране, и в цитозоль высвобождаются цитохром С и
другие факторы, такие как Smac/Diabolo, который способствует активации каспаз
путем нейтрализации ингибиторных эффектов белков IAPs (Fulda and Debatin, 2006).
Баланс между анти- и проапоптозными членами Bcl-2 семейства вкупе с каспазоингибирующими молекулами IAP, позволяет клетке быть пластичной с точки зрения
запуска ПКГ и справляться с небольшими повреждениями митохондрий, при этом
блокируя апоптоз (Herr et al., 2007).
В ЦНС ключевыми белками семейства Bcl-2 являются антиапоптозный белок
Bcl-XL и проапоптозный белок Bax (van Delft and Huang 2006; Hacker and Weber
2007). Ген bcl-x находится в 20 хромосоме у человека и в 3 хромосоме у крысы. В
промоторе bcl-x есть сайты связывания транскрипционных факторов Est-2, ReI/NF-kB,
STAT, AP-1, также расположено несколько глюкокортикоид-отвечающих элементов
генома (GRE – glucocorticoid-response element) (Gascoyne, Kypta et al. 2003; Viegas,
Vicent et al. 2004). Благодаря альтернативному сплайсингу возможны три варианта
продуктов гена: Bcl-XL, Bcl-Xβ с антиапоптозной и Bcl-Xs с проапоптозной
активностями (Gonzalez-Garcia, Garcia et al. 1995; Merry and Korsmeyer 1997). Bcl-XL
высоко гомологичен Bcl-2 и экспрессируется на высоком уровне как в эмбриональных
тканях, так и во взрослом организме (Akhtar et al., 2004). У Bcl-XL есть С-концевой
трансмембранный (TM) домен и все домены Bcl-2 гомологии. Установлено что BH1BH3 формируют гидрофобный карман, и с N-конца BH4 домен стабилизирует эту
структуру (Borner, 2003). Сайт-направленный мутагенез в BH доменах приводит к
15
потере антиапоптозной функции Bcl-2 белков. Благодаря этому гидрофобному
карману Bcl-XL может образовывать гетеродимеры с Bax, Bak, Bid и BAD (Borner,
2003).
Ген bax находится в 19 хромосоме у человека и в хромосоме 1 у крысы.
Промотор этого гена содержит 4 сайта связывания белка p53, а также потенциальные
GRE-элементы (Hoijman, Rocha Viegas et al. 2004). Известно несколько вариантов
белковых продуктов гена: Bax-α (21 kDa), Bax-β (24 kDa), Bax-γ (4.5 kDa), Bax-δ (16
kDa), Bax-ε (18 kDa), Bax-κ (19 kDa) и Bax-ω (24 kDa) (Goping, Gross et al. 1998). В
ЦНС в основном экспрессируется Bax-α. Bax имеет 3 домена Bcl-2 гомологии: BH1BH3 и трансмембранный домен TM (Goping, Gross et al. 1998). За счет высокой
мобильности BH3 домена Bax может менять конформацию, что приводит к
высвобождению этого домена на поверхность белка и связыванию его с
антиапоптозными белками Bcl-2 семейства. Молекулы Bax in vivo в норме
функционально неактивны, так как антиапоптозные Bcl-2 белки способны изменять
свойства мембраны митохондрий, затрудняя транслокацию Bax в неё, а также
инактивировать BH3 домены Bax (Hacker and Weber, 2007). В экспериментальных
условиях Bax действительно связывается с Bcl-2, однако в норме Bax находится в
цитозоле, а Bcl-2 ассоциирован с мембраной (van Delft and Huang, 2006). BH3 домен
Bax при образовании комлекса с Bcl-XL принемает структуру гидрофобной αспирали. Эта спираль помещается в гидрофобный карман Bcl-XL и образует с ним
гидрофобные и электростатические связи. Важная функция BH3 домена состоит также
и в связывании собственного TM домена, и тогда белок локализован в цитозоле
(Borner, 2003). Изменение конформации, в ответ на апоптозный сигнал, освобождает
TM домен от экранирования BH3 доменом, и при этом происходит транслокации Bax
из цитозоля во внешнюю мембрану митохондрий (Nechushtan et al., 1999). После
транслокации Bax формирует крупные олигомерные комплексы и образует поры в
наружней мембране митохондрий in vitro и in vivo (Jurgensmeier, Xie et al. 1998). В
этих комплексах могут присутствовать и другие белки, такие как VDAC (voltage
dependent anion channel), tBid и Map-1 (Borner, 2003). Из-за образования пор и\или
16
активации этих каналов Bax индуцирует высвобождение из митохондрий цитохрома С
и других факторов апоптоза (например, Smac\Diablo) (Herr et al., 2007).
1.1.3. Пути запуска апоптоза
У млекопитающих основными путями запуска апоптоза, как уже отмечалось,
являются так называемые митохондриальный (внутриклеточный) и рецепторный
(экстраклеточный).
Внутренний митохондриозависимый путь отвечает за внутриклеточные сигналы,
в ходе его реализации происходит высвобождение проапоптозных молекул вследствие
изменений митохондриальной мембраны (Green and Kroemer, 2004). В ходе
реализации митохондриального пути запуска апоптоза происходит изменение баланса
про- и антиапоптозных белков Bcl-2 белков в сторону проапоптозных (Hacker and
Weber, 2007). В ЦНС при этом снижается отношение экспрессии Bcl-XL/Bax – двух
важнейших регуляторов апоптоза в этой ткани, что приводит к высвобождению
факторов апоптоза из митохондрий и последующей активации каспазвы-3 (Yuan and
Yankner, 2000).
В начале рецепторного пути на плазматической мембране находятся рецепторы
(TNFR, Fas/CD95, DR3, DR4/DR5) с доменами «смерти» (death-domains). Связывание
этих рецепторов с лигандами (TNFα, Fas/CD95L, TWEAK и TRAIL) способно
инициировать программу апоптоза (Antonsson, 2004). После связывания лиганда,
«рецептор смерти» олигомеризуется и, путем привлечения адапторной молекулы
FADD, каспазы-8 и белка FLIP – ингибитора каспазы-8, – формирует DISC(Death
inducing signaling complex) (Sprick, Rieser et al. 2002). Каспаза-8 в составе DISC
автокаталитически
молекулярному
активируется,
каскаду
а
также
исполнительную
активирует
каспазу.
нижележащую
Этот
процесс
по
имеет
митохондриозависимый и митотохондрия-независимый пути (Almasan and Ashkenazi
2003). В ходе первого процесса, каспаза-8 расщепляет Bid, проапоптозный белок Bcl-2
семейства, переводя его активную форму, которая в свою очередь запускает процесс
высвобождения цитохрома C из митохондрии. Цитохром С связывается с APAF-1,
активируя
инициаторную
каспазу-9,
которая,
в
свою
очередь,
активирует
17
эффекторные каспазы. В митохондрио-независимом пути, каспаза-8 изначально
активируется по тому же самому механизму, а затем непосредственно, без вовлечения
в этот процесс митохондрии или цитохрома С, активирует расщеплением каспазу-3 –
ключевую эффекторную протеазу апоптоза, что является узловой точкой соединения
рецепторного и митохондриального путей (Herr et al., 2007).
Существуют, однако, и каспазо-независимые пути реализации программы гибели
клеток. AIF и эндонуклеаза G высвобождаются из митохондрии при нарушении
целостности наружной митохондриальной мембраны и транслоцируются в ядро,
способствуя конденсации хроматина и фрагментации ДНК (Singh, Brooke et al. 2010).
Каспазо-независимый путь гибели клеток взаимосвязан с каспазо-зависимым: так,
активные молекулы каспаз (Lu, Fan et al. 2003; Wang, Cheng et al. 2003) и каспазоактивируемые белки t-Bid и Egl-1 (Lassus, Opitz-Araya et al. 2002) способны запускать,
а ингибиторы каспаз (Lu, Fan et al. 2003; Wang, Cheng et al. 2003) супрессировать
высвобождение AIF из митохондрий (Singh, Brooke et al. 2010). В центральной
нервной системе наиболее распространен каспазо-зависимый митохондрио-зависимый
путь реализации апоптоза, в ходе которого белки Bcl-2 семейства «воспринимают»
молекулярные сигналы об изменениях в клетке, что позволяет ей адекватно
реагировать на колебаниия условий существования. Один из важнейших типов таких
сигналов приходит от рецепторов нейротрофинов и факторов роста, локализованных
на плазматической мембране
1.2. Нейротрофины – регуляторы жизнеспособности и гибели нервных клеток
Регуляция
роста,
дифференцировки
и
выживания
клеток
в
условиях
многоклеточного организма требует точной межклеточной координации. Это
особенно важно для нервной системы, состоящей из миллиардов клеток, которые в
ходе онтогенеза должны сформировать правильно функционирующие нейронные
сети. Подобный процесс обеспечивается тем, что незрелые нейроны конкурируют за
трофические факторы от клеток, их иннервирующих. Выживают лишь те из незрелых
нейронов, которым удается установить правильные синаптические связи с клетками,
18
дающими им трофическую «подпитку» сигнальными белками, важнейшими из
которых являются белки семейства нейротрофинов (Yuan and Yankner, 2000).
В начале 50-х годов был впервые описан фактор роста нервов – NGF (LeviMontalcini and Hamburger, 1951) и за это открытие авторам в 1986 была присуждена
Нобелевская премия по физиологии и медицине. Позднее у позвоночных было
открыто
несколько
структурно
гомологичных
нейротрофических
факторов,
отнесенных к семейству NGF и названых нейротрофинами. К ним относятся BDNF
(мозговой нейротрофический фактор), NT-3 (нейротрофин-3), NT-4/5 (нейротрофин4/5) (Barde, 1989). Другие члены семейства – нейротрофин-6 (NТ-6) и нейротрофин-7
(NТ-7) экспрессируются только у некоторых видов костистых рыб, но не у других
видов позвоночных (Gotz, Koster et al. 1994; Lai, Fu et al. 1998). Делеции в генах
нейротрофинов приводят к потерям определенных популяций нейронов в нервной
системе позвоночных (Lu et al., 2005).
Структура
нейротрофинов
высоко
консервативна
(Hallbook,
1999),
за
исключением NT-4/5, который имеет с другими нейротрофинами лишь 50%
гомологии по аминокислотной последовательности (Chan, Cosgaya et al. 2001).
Важной особенностью структуры всех нейротрофинов является присутствие 6-ти
остатков цистеина, за счёт которых формируются дисульфидные мостики (Bartkowska
et al., 2010). Нейротрофины синтезируются как пре-пробелки в нейронах и глии
(Thoenen 1995; Seidah, Benjannet et al. 1996). Белковые продукты всех генов,
кодирующих нейротрофины, содержат сигнальный пептид для секреции белка (пребелок) и белок-предшественник (про-белок). Когда гидрофобный район сигнального
пептида отщепляется от пре-пробелка на N-конце, образуется пронейротрофин
(Bartkowska et al., 2010). Далее, от пронейротрофина в эндоплазматическом
ретикулуме отщепляется второй сигнальный домен с образованием зрелого
нейротрофина, что является важным этапом в регуляции процессов выживания и
гибели нейронов и глиальных клеток (Lu et al., 2005).
Зрелые нейротрофины (молекулярной массой 12-15 Кда) секретируются в
межклеточное пространство в форме гомодимеров (Lu et al., 2005), пронейротрофины
(28-35 Кда) также могут быть транспортированы к плазматической мембране и
19
высвобождаться в непроцессированной форме (Seidah, Benjannet et al. 1996). Про- и
зрелые формы нейротрофинов действуют как паракринные и/или аутокринные
регуляторы, контролирующие в ходе развития многие важнейшие клеточные
процессы, такие как пролиферация, миграция, дифференцировка, выживание и
апоптоз, а также синаптическую пластичность (Lu et al., 2005). В случае если
молекула пронейротрофина не успела связаться с рецептором, внеклеточные плазмин
или металлопротеиназа 7 переводят её в молекулу зрелого нейротрофина путем
расщепления (Pang, Teng et al. 2004).
1.2.1. Экспрессия нейротрофинов и их рецепторов
Различные нейрональные популяции нуждаются в неодинаковых уровнях
трофической поддержки, и при этом степень потребности в ней изменяется у них в
процессе онтогенеза. Так, нейроны ядра дорсального пути (dorsal root ganglia) зависят
от поступления в них NGF лишь в краткий период времени в течение раннего
онтогенеза (Lindsay, 1988). В соответствии с указанной общей закономерностью,
экспрессия трофических факторов (Maisonpierre, Belluscio et al. 1990) и их рецепторов
(Friedman et al., 1991) в ЦНС изменяется в ходе развития. К тому же, NGF, BDNF и
NT-3 имеют частично перекрывающиеся спектры влияния на периферические ганглии
и картины межрегионального распределения в ЦНС взрослых животных (Ernfors,
Ibanez et al. 1990).
Из рецепторов нейротрофинов, TrkB начинает экспрессироваться в нервной
трубке позднее, чем TrkC, а TrkA в ходе раннего развития не обнаруживается (Bernd,
2008).
p75NTR, напротив, экспрессируется в нервной системе, начиная с самых ранних
стадий развития: уже к 7 дню эмбриогенеза крыс наблюдается его экспрессия в
формирующемся ядре дорзального пути (Ernfors, Hallbook et al. 1988). В течение
последующих дней p75NTR экспрессируется в симпатических и сенсорных ганглиях, а
также в переднем мозге (Buck et al., 1987). В ветро-латеральной стенке мозгового
пузыря экспрессия p75NTR впервые обнаруживается на 13 день эмбриогенеза, и затем
она увеличивается (Koh and Loy, 1989). У обезьян экспрессия этого белка впервые
20
наблюдается на 56-ой день эмбрионального развития (Е56), в особенности в зоне
субпластинки (Meinecke and Rakic, 1993).
В ходе постнатального развития крыс наблюдаются как межрегиональные
различия в уровнях экспрессии p75NTR в мозге, так и их изменения в ходе онтогенеза
(Koh and Higgins, 1991). К примеру, уровень мРНК p75NTR в клетках мозжечка
наиболее высок на 2 день жизни, а затем он постепенно снижается в ходе дальнейшего
развития, в отличие, к примеру, от холинергических нейронов базальных ядер, где он
остается высок (Koh and Higgins 1991; Chen, Kinsman et al. 1994).
Наиболее широко представленным в ЦНС нейротрофином является BDNF. Белок
пре-proBDNF имеет массу ~32 КДа, proBDNF – ~28 КДа, а зрелый нейротрофин – 14
Кда (Aid et al., 2007). Ген BDNF у грызунов содержит восемь 5’-экзонов с промотором
перед каждым из них и один 3’-экзон, кодирующий белок BDNF. Транскрипты
состоят либо из одного из 5’-экзонов, присоединенного к 3’-экзону, либо одного
кодирующего 3’-экзона. Промоторы гена BDNF функционируют тканеспецифическим
образом (Aid et al., 2007). В отличие от грызунов, у человека в ДНК на
комплементарной цепи гена BDNF имеется последовательность antiBDNF, с которой
считывается некодирующая РНК antiBDNF (Pruunsild, Kazantseva et al. 2007). Она
является естественной интерферирующей РНК и, по всей видимости, подавляет
экспрессию мРНК BDNF (Pruunsild, Kazantseva et al. 2007).
Транскрипцию гена BDNF у крыс регулируют различные факторы, в числе
которых CREB (cAMP-responsive element binding protein), USF1/2 и CaRF (calciumresponsive transcription factor). В нервной системе на экспрессию BDNF также влияют
кальций-зависимые
процессы,
связанные
с
ГАМК-
и
глутаматэргической
нейротрансмиссией (Aid et al., 2007). BDNF участвует в процессах консолидации
памяти, роста дендритов, синаптической пластичности. В развивающемся мозге одной
из ключевых функций этого нейротрофина является регуляция процессов апоптоза
(Chao, 2003).
Мыши с делецией в гене BDNF рождаются живыми, но большинство из них
гибнет ещё до второй недели жизни (Ernfors, Lee et al. 1994). У них нарушены
координация движений и чувство равновесия. Делеция приводит к потере клеток в
21
области ядер дорсального пути, тройничного нерва (Ernfors, Lee et al. 1994),
тройничных ядер лицевого нерва (Patel and Krimm 2010), а также черепных и
спиномозговых сенсорных ядер (Jones, Farinas et al. 1994) (Bianchi et al., 1996). У
гомозигот с нокаутом по bdnf наибольшим изменениям подвержен таламус (Lotto,
Asavaritikrai et al. 2001), чёрная субстанция (Baker et al., 2005) и мозжечок (Schwartz et
al., 1997). У гетерозигот по этой делеции BDNF в зрелом возрасте ослаблена
способность к обучению, повышена тревожность (Lu et al., 2005). Блок синтеза мРНК
BDNF у крыс посредством РНК-интерференции приводит к снижению нейрогенеза в
зубчатой извилине гиппокампа (Taliaz, Stall et al. 2010).
Экспрессия BDNF в ЦНС
В отличие от основных белков апоптозного каскада, практически повсеместно
экспрессирующихся в мозге, начиная с ранних стадий онтогенеза (van Delft and Huang,
2006), BDNF обладает специфическими возраст-зависимыми паттернами экспресии в
различных отделах развивающегося мозга (Friedman et al., 1991).
BDNF вносит вклад уже в ходе раннего развития, вызывая увеличение числа
мотонейронов в нервной трубке (Bernd, 2008). На 10-12 дни эмбрионального развития
крыс BDNF уже экспрессируется в ядре тройничного нерва (Arumae, Pirvola et al.
1993). Начиная с 13 дня эмбриогенеза BDNF обнаруживается в нейробластах
неокортикальной субпластинки и развивающихся кортикальных пластинок, рост
уровня BDNF в которых продолжается до 18 дня эмбриогенеза (Fukumitsu, Furukawa
et al. 1998). Показано высвобождение pro-BDNF в культивируемых нервных клетках
эмбрионов начиная с 18 дня беременности (Mowla et al., 1999). Спонтанная
нейрональная активность значительно возрастает по BDNF-зависимому механизму
как раз в этот срок (Е18) (Aguado, Carmona et al. 2003). По-видимому, в более ранние
периоды развития степень дифференцировки нейронной сети недостаточна, чтобы
поддерживать высвобождение pro-BDNF (Willnow et al., 2008).
Уровень экспрессии BDNF в мозге вцелом и в различных мозговых структурах
значительно изменяется в ходе онтогенеза. В постнатальный период развития уровень
22
белка BDNF в мозге повышается и у крыс достигает пика на 30 день жизни (Schoups,
Elliott et al. 1995).
Каудальные области ствола мозга, которые созревают раньше, чем ростральные
области, начинают экспрессировать мРНК BDNF в более ранний период (Friedman et
al., 1991).
В коре мозга и гиппокампе обнаружены 2 различных транскрипта BDNF, длиной
1.4 и 4.2 kb (Maisonpierre, Belluscio et al. 1990; Friedman, Ernfors et al. 1991).
Экспрессия BDNF в гиппокампе довольно низка в раннем постнатальном периоде, но
достигает высоких значений в CA3 и CA4 областях и зубчатой извилине ко второй
неделе жизни (Maisonpierre, Belluscio et al. 1990), а относительное содержание двух
транскриптов изменяется в зависимости от возраста: экспрессия большего сильнее
выражена в раннем возрасте, в то время как профиль экспрессии меньшего по размеру
транскрипта имеет менее выраженную зависимость от стадии развития. Оба
транскрипта экспрессируются на низком уровне у животных недельного возраста, пик
достигается на 4-5 неделе жизни (Friedman et al., 1991).
В коре небольшое количество мРНК BDNF обнаруживается уже к концу первой
недели жизни, немного возрастает к концу второй недели и после этого остается на
стабильном уровне. В отличие от гиппокампа, в коре относительное содержание двух
транскриптов не изменяется с возрастом. В большинстве областей коры экспрессия
мРНК BDNF ярко проявляется лишь после двух недель жизни (Friedman et al., 1991). В
затылочной коре, напротив, уровни мРНК BDNF и его рецептора TrkB наиболее
велики в раннем постнатальном периоде и снижаются с возрастом (Sugiyama, Kanba et
al. 2003).
В субкортикальных структурах переднего мозга, а также в некоторых областях
гипоталамуса содержание мРНК BDNF в ходе раннего развития низко, но в
дальнейшем оно стойко повышается. Известно, что в пириформной коре мРНК BDNF
экспрессируется уже в первый день постнатального онтогенеза крыс, а в сингулярной
коре её экспрессия обнаруживается лишь в возрасте 1 недели (Friedman et al., 1991).
В некоторых областях переднего мозга, включая переднее паравентрикулярное
ядро таламуса, преоптическую зону и вентромедиальное ядро гипоталамуса,
23
содержание мРНК BDNF низко относительно гиппокампа и коры. В ходе онтогенеза
её уровень в вентромедиальном ядре гипоталамуса динамически изменяется, достигая
своего пика на 4 день, и спадает до минимального уровня у взрослых животных.
мРНК BDNF также экспрессируется в ходе развития в некоторых областях ствола
мозга (в черной субстанции и interpeduncular ядрах), но её экспрессия там высока
лишь на ранних стадиях развития (Friedman et al., 1991).
У взрослых животных содержание мРНК BDNF наиболее высоко в зубчатой
извилине и CA3 области гиппокампа, фронтальной, париетальной и пириформной
коре и миндалине (Pruunsild, Kazantseva et al. 2007). Значительные количества мРНК
BDNF у взрослых животных также обнаружены области перегородки и мозжечке
(Ernfors, Ibanez et al. 1990), в ядрах передней комиссуры и ретроспинальной
гранулярной коре (Sugiyama, Kanba et al. 2003).
Низкие уровни свободного BDNF наблюдаются также в плазме крови, и
обнаружена корреляция между уровнями белка BDNF в плазме и в мозге (Radka et al.,
1996).
Влияние BDNF или его предшественника на популяции нейронов определяется
не только общим содержанием транскрипта гена bdnf, но и тем, какая из форм этого
нейротрофина, зрелая или незрелая, преимущественно секретируется клетками данной
структуры мозга, а также, на некоторых стадиях развития организма, уровнями
экспрессии рецепторов нейротрофинов (Lu et al., 2005).
Экспрессия TrkB в ЦНС
Основным рецептором для BDNF является TrkB (Lu et al., 2005). Мыши,
гомозиготные по делеции в гене trkB рождаются живыми, но большинство из них
гибнет в течение первых 48 часов жизни. У них наблюдаются нарушения
формирования ядер лицевого и тройничного нервов, что не позволяет им кормиться
молоком и вызывает гибель от голода. У этих животных выявлены нарушения
структуры и функционирования некоторых сенсорных ядер: вестибюлярных и
кохлеарных (Silos-Santiago, Fagan et al. 1997), ганглия дорсального пути (Perez-Pinera,
Garcia-Suarez et al. 2008), а также апоптоз клеток во многих областях мозга (Alcantara
24
et al., 1997). Мутантные мыши, у которых отсутствует как полная, так и укороченная
изоформы TrkB были подвержены менее ощутимым нейрональным потерям, по
сравнению с животными, дефицитными только по полному варианту этого рецептора
(Bartkowska et al., 2010). Это может говорить о взаимокомпенсирующем действии
полных и укороченных вариантов TrkB. Отсутствие только укороченной формы TrkB
вызывает уменьшение длины дендритов нейронов миндалины (Carim-Todd, Bath et al.
2009).
Полный вариант TrkB экспрессируется в мозге в раннем эмбриогенезе: у крыс
начиная с Е13-14 (Fukumitsu, Furukawa et al. 1998), у мышей с E12.5 (Islam, Loo et al.
2009). У эмбрионов крыс на Е13 содержание TrkB высоко в клетках примордиального
плексиформного слоя коры (cortical primordial plexiform layer) и вентрикулярной зоны.
Экспрессия TrkB, которая наблюдается в нейронах кортикальной пластинки и
субпластинки на Е18, исчезает к Е20 (Fukumitsu, Furukawa et al. 1998). В области
поясной (cingulate) и энторинальной (entorhinal) коры экспрессия TrkB проявляется на
Е18 и увеличивается вплоть до момента рождения, в то время как экспрессия мРНК
BDNF в затылочной коре имеет место лишь в постнатальном периоде (Fryer, Kaplan et
al. 1996).
Как уже отмечалось, в ходе эмбрионального развития крыс в их мозге
наблюдаются определенные межрегиональные и межвозрастные различия в уровнях
экспрессии p75NTR, с высокой специфичностью связывающегося с незрелой формой
BDNF (Koh and Loy, 1989). Однако, несмотря на некоторые различия в профилях
экспрессии рецепторов BDNF в отделах головного мозга во внутриутробный период
развития, в постнатальном онтогенезе оба типа рецепторов в норме широко
экспрессируются по всему мозгу, и имеют лишь незначительные межрегиональные
различия в уровнях экспрессии (Koshimizu, Kiyosue et al. 2009), и, следовательно, не
вносят
значительный
предшественника.
вклад
в
реализацию
эффектов
BDNF
и
его
белка-
25
1.2.2. Молекулярные механизмы действия нейротрофинов
Действие
филогенетически
родственных
нейротрофических
факторов
опосредованно их связыванием с тирозинкиназными рецепторами плазматической
мембраны семейства Trk (TrkA, TrkB и TrkC, Trk – tropomyosin-related kinase) (Lu et
al., 2005). Каждый из Trk рецепторов имеет избирательно повышенное сродство к
определенному нейротрофину. Все Trk-рецепторы состоят из 3х структурных
доменов: внеклеточного лиганд-связывающего участка, включающего 2 цистеин
богатых кластера, за одним из которых следуют три лейцин-богатых повтора и 2
иммуноглобулин-подобных
кластера;
трансмембранный
участок
и
цитоплазматический участок, где расположен тирозинкиназный каталитический
домен. Второй иммуноглобулин-подобный домен позволяет каждому из трёх типов
Trk-рецепторов селективно связываться с определенными нейротрофинами с большей
аффинностью, чем с другими (Bartkowska et al., 2010). Эффекты каждого из
нейротрофинов практически исчезают у нокаутов по генам соответствующих Trk
рецепторов (Lu et al., 2005). Описано множество изоформ Trk рецепторов: 4 изоформы
TrkA, 8 изоформ TrkB и 6 изоформ TrkC. Полные варианты Trk-рецепторов являются
основными в ходе раннего развития, в то время как укороченные формы превалируют
позднее (Bartkowska et al., 2010).
Связывание молекулы нейротрофина вызывает димеризацию Trk-рецепторов,
что приводит к активации тирозинкиназных каталитичеких доменов путем их ауто
транс-фосфорилирования по остаткам тирозина (Huang and Reichardt, 2003) и
последующему
вовлечению
других
сигнальных
молекул
по
разнообразным
механизмам: путем связывания фосфатидилинозитол-3-киназы с SH2-доменом
(Carpenter, Auger et al. 1993), путем фосфорилирования PLC-c и STAT (Sadowski et al.,
1993), путем направления Sos к мембране и активации Ras-пути (Nguyen, Lee et al.
2009).
(PI3K)/Akt-зависимый путь вовлечен в сигнальную трансдукцию тирозинкиназных рецепторов (Ye, Hurt et al. 2000). Активация Akt приводит к
фосфорилированию проапоптозного белка BAD Bcl-2 семейства и ингибированию его
проапоптозных функций (del Peso, Gonzalez-Garcia et al. 1997) и предотвращает
26
индукцию каспазы-9 (Cardone, Roy et al. 1998). К тому же, трансдукция сигнала через
фосфатидилинозитол-3-киназу ведёт к подавлению экспрессии транскрипционного
фактора forkhead, стимулирующего экспрессию белка BAD и других проапоптозных
белков (Brunet, Bonni et al. 1999). Активированная PI3-Akt блокирует олигомеризацию
Bax на митохондриальной мембране (Chao, 2003). Также показано, что Akt
способствует выживанию нейронов гиппокампа путём ингибирования активности p53
(Bonni, Brunet et al. 1999), а ядерная фракция Akt препятствует фрагментации ДНК
путем ингибирования CAD (Caspase-activated DNase) (Ahn, Liu et al. 2006).
Trk-рецепторы также активируют MAPK-MEK сигнальный каскад (MAPK –
митоген-активируемая
протеинкиназа,
MEK
–
MAPK/ERK
киназа),
который
опосредует митогенез, дифференцировку и гибель клеток в зависимости от степени
активации и транслокации в ядро (Robinson and Cobb, 1997). Активация MAPK
стимулирует экспрессию антиапоптозных белков, в том числе Bcl-2, а также
транскрипционного фактора CREB (cyclic AMP responsive element-binding protein) (Lu
et al., 2005). К белкам-мишеням MAPK относится Rsks, которая фосфорилирует
проапоптозный белок BAD и транскрипционный фактор CREB (Nguyen, Lee et al.
2009). Фосфорилирование BAD ингибирует апоптоз, а фосфорилирование CREB
способствует выживанию клеток (Bonni, Brunet et al. 1999; Nguyen, Lee et al. 2009).
Пронейротрофины
с
высокой
аффинностью
связываются
с
членом
суперсемейства TNF-рецеторов, p75NTR, имеющим низкое сродство к зрелым
нейротрофинам
(Bartkowska,
2010).
Предшественники
нейротрофинов
взаимодействуют с p75NTR или с ко-рецепторным комплексом p75NTR с сортилином,
Vps10p домен-содержащим трансмембранным белком, способствуя, соответственно,
либо выживанию, либо гибели клеток (Nykjaer, Lee et al. 2004).
p75NTR состоит из внеклеточного района, содержащего 4 цистеин-богатых
домена, единственного трансмембранного домена и внутриклеточного домена,
характерного для всех представителей семейства TNF-рецепторов, который может
взаимодействовать с несколькими апоптоз-активирующими сигнальными белками, а
также с белками, содержащими PDZ домен (PDZ – Рost synaptic density protein
(PSD95), Drosophila disc large tumor suppressor (Dlg1), and Zonula occludens-1 protein
27
(zo-1) – впервые обнаружен в этих белках), которые служат для реализации процессов
внутриклеточного транспорта и образования рецепторного комплекса с участием
p75NTR (Coulson, Reid et al. 2004).
Мыши, дефицитные по p75NTR имеют нарушения в периферической нервной
системе (Jahed and Kawaja 2005). У них проявляются изменения в поведении и
наблюдаются потери нейронов в базальной части переднего мозга, но при этом размер
нейронов в этом отделе мозга увеличен (Peterson, Dickinson-Anson et al. 1999).
p75NTR
способен
формировать
с
Trk-рецептором
гетерокомплекс,
что
способствует усилению Trk-сигналинга. p75NTR способен оказывать влияние на
дифференцировку клеток и их синаптическую пластичность независимо от Trk. В
разных условиях он способен стимулировать противоположные процессы, такие как
выживание нервных клеток и апоптоз (Willnow et al., 2008). К примеру, активация
цитоплазматического района p75NTR приводит к активации nuclear factor-κB (NFκB) и
реализции трофических эффектов нейротрофинов, либо к активации проапоптозной
киназы JNK (Jun N-terminal kinase). Последняя вызывает фосфорилирование c-Jun, и, в
результате, активирует проапоптозное действие Bax (Pruunsild, Kazantseva et al. 2007).
У клеточной поверхности и в эндосомах, p75NTR подвергается расщеплению γсекретазой в ходе процесса, называемого регулируемым внутримембранным
протеолизом (RIP - regulated intramembrane proteolysis) (Bronfman, Tcherpakov et al.
2003), который может приводить и к выживанию, и к гибели клеток, в зависимости от
особенностей экспрессии других регуляторных белков в данной клетке (Underwood,
Reid et al. 2008). В нейронах симпатической системы, Шванновских клетках и
фоторецепторах proNGF и proBDNF индуцируют регулируемый внутримембранный
протеолиз p75NTR и высвобождение его внутриклеточного домена, вследствие чего
адапторная молекула для p75NTR – NRIF (neurotrophin receptor interacting factor)
транслоцируется в ядро, индуцируя апоптоз (Volosin, Trotter et al. 2008; Willnow,
Petersen et al. 2008).
Связывание пронейротрофинов с p75NTR в сопряжении с сортилином приводит к
нейротоксическим эффектам (Nykjaer, Lee et al. 2004). Одновременное связывание
продомена пронейротрофина с сортилином и «зрелой» части пронеротрофина с p75NTR
28
усиливает взаимодействие с рецепторами (Nykjaer, Lee et al. 2004). Сортилин
связывает зрелый NGF, proNGF, proBDNF и proNT-3 (Willnow et al., 2008). proNGF
способен вызывать апоптоз даже в присутствии трофической поддержки зрелого NGF,
что говорит от том, что сигнал индуцирующий гибель может перекрывать
нейропротективные
сигналы,
и
продолжать
давать
вклад
в
процессы
нейродегенерации (Volosin, Trotter et al. 2008).
1.2.3. Нейротрофины и апоптоз в онтогенезе ЦНС
В ходе развития ЦНС на клеточном уровне последовательно и взаимосвязано, но
не одновременно, а гетерохронно, в разных структурах головного мозга происходят
пролиферация, миграция, дифференцировка, формирование отростков нейронов и
образование синаптических контактов (Oppenheim, 1991). Так, нейроны ствола мозга
крысы заканчивают формирование в эмбриональном периоде, а нейроны коры и
гиппокампа оформляются лишь в первые дни после рождения (Meier et al., 2000).
Мозг новорожденного крысенка по стадии формирования соответствует мозгу плода
человека на 22-24 неделе беременности и достигает стадии развития мозга
новорожденного ребенка лишь к 7-8 дню жизни (Whitelaw and Thoresen, 2000).
Нервным
клеткам-предшественникам
необходимо
установить
правильные
контакты с их мишенями иннервации, дающими трофическую поддержку. Эту
трофическую поддержку в значительной степени обеспечивают белки семейства
нейротрофинов, наиболее значительную роль из всех нейротрофинов в ЦНС играет
мозговой
нейротрофический
фактор
(BDNF)
(Chao,
2003).
Зрелые
формы
нейротрофинов преимущественно обладают антиапоптозными эффектами. Введение
нейротрофинов в мозг предотвращает потерю нейронов, связанную с возрастом или
вызванную механическим или химическим воздействием (Lu et al., 2005). Влияние
пронейротрофинов, напротив, в значительной степени способствует индукции
апоптоза нервных клеток, однако у них имеются и антиапоптозные эффекты (Willnow
et al., 2008). Функция пронейротрофинов, состоящая в регуляции элиминации
поврежденных
клеток,
олигодендроцитов,
была
показана
шванновских
для
клеток,
нейронов
развивающейся
кортикоспинальных
ЦНС,
нейронов,
29
фоторецепторов, гладкомышечных клеток и нейронов верхних шейных ганглиев (Lu
et al., 2005). Повышенная секреция пронейротрофинов в случае нейродегенерации или
повреждения нейронов может способствовать гибели клеток (Willnow et al., 2008).
При болезни Альцгеймера, инсультах или других поражениях ЦНС, уровень
пронейротрофинов повышается, что указывает на их важную роль в индукции
массовой гибели нервных клеток (Stoica, Lungu et al. 2008).
Пронейротрофины также могут способствовать выживанию нервных клеток и
росту нейрональных отростков, хотя их действие менее выражено по сравнению со
зрелыми нейротрофинами (Buttigieg et al., 2007). Данный трофический эффект, повидимому, связан с тем, что эндоцитоз пронейротрофинов и их последующий
протеолитический процессинг в эндосомах может приводить к ресекретированию
молекул
зрелого
нейротрофина,
которые,
в
свою
очередь,
связываются
с
соответственными Trk-рецепторами плазматической мембраны, оказывая своё
нейропротективное действие (Boutilier, Ceni et al. 2008).
Для образования корректных взаимосвязей между нейронами образуется
большое количество нейрональных клеток-предшественников. Избыточные нейроны,
не образовавшие правильных контактов, элиминируются в основном путем апоптоза.
В ходе развития мозга погибает более половины изначально закладываемых нейронов
(Oppenheim, 1991). У грызунов элиминация нервных клеток начинается с 11-12 дня
эмбрионального развития и продолжается до раннего постнатального периода. В эти
сроки селективная гибель клеток происходит в различных регионах и популяциях
нейроцитов по всей ЦНС (Oppenheim, 1991). При этом, клетки наиболее интенсивно
элиминируются в зонах головного мозга с повышенной клеточной пролиферацией,
тогда как в постмитотических регионах апоптоз встречается реже (Blaschke, Staley et
al. 1996).
Основные черты программируемой гибели нейронов схожи с таковыми у клеток
других типов (Yuan and Yankner, 2000). Нейроны различных популяций и на разных
стадиях развития экспрессируют различные комбинации Bcl-2 белков и белков
семейства каспаз, но имеются и неизменные участники апоптоза клеток нервной
системы (Yuan and Yankner, 2000). Среди антиапоптозных белков Bcl-2 семейства
30
таким участником является Bcl-XL. Этот белок экспрессируется в формирующемся
мозге и его уровень не уменьшается во взрослой жизни (Antonsson, 2004). Мыши с
делецией в гене Bcl-X погибают в районе 13-го дня эмбриогенеза с признаками
массированного апоптоза клеток центральной нервной системы (Parsadanian, Cheng et
al. 1998; Roth and D'Sa 2001). Значимость белка Bcl-XL для предотвращения апоптоза
моторных
нейронов,
нейронов
гиппокампа
и
коры
в
раннем
онтогенезе
продемонстрирована с помощью оверэкспрессии его гена in vivo (Parsadanian, Cheng et
al. 1998).
Важным в раннем онтогенезе представителем проапоптозных белков является
экспрессирующийся в мозге практически повсеместно Bax (Roth and D'Sa 2001; Hacker
and Weber 2007). У мышей с делецией в гене Bax увеличено число клеток верхних
шейных ганглиев и ядер лицевого нерва, а их симпатические нейроны и мотонейроны
более устойчивы к апоптозу, индуцированному дефицитом NGF или аксонотомией в
неонатальный период развития (van Delft and Huang, 2006).
Среди протеаз наиболее важной в осуществлении апоптоза клеток ЦНС является
каспаза-3. Например, апоптоз формирующихся симпатических нейронов происходит
только с участием каспазы-3 (Wright, Vaughn et al. 2007). Нокауты по каспазе-3
гибнут, и в их мозге выявляются скопления избыточных нейронов в области коры,
гиппокампа и полосатого тела (Yuan and Yankner, 2000).
Исходя из вышесказанного, справедливо утверждать, что про- и зрелая формы
BDNF, а также белки апоптозного каскада Bax, Bcl-XL и каспаза-3 играют ключевые
роли в регуляции и реализации апоптоза в развивающейся нервной системе.
Изменение экспрессии этих белков может вносить заметные изменения в процессы
развития ЦНС, зависящие, в том числе, и от средовых факторов стрессорной природы.
Действующими на развитие мозга агентами таких факторов могут быть стероидные
гормоны стресса – глюкокортикоиды.
31
1.3. Роль глюкокортикоидов в регуляции апоптоза в развивающейся нервной
системе
В ответ на стресс активируется секреция глюкокортикоидов клетками пучковой
зоны коры надпочечников. Действие этих гормонов направлено на обеспечение
адаптации организма к стрессорному воздействию. Глюкокортикоиды влияют на
углеводный, белковый и липидный обмен (McKay and Cidlowski, 1999). Базальный
уровень этих гормонов в крови необходим для поддержания нормального уровня
сахара в крови, тогда как повышение уровня глюкокортикоидов вызывает рост
содержания глюкозы в плазме крови, индуцирует гибель лимфоцитов и эозинофилов,
угнетает воспалительные процессы в организме, изменяет водный и солевой обмен
(Sapolsky et al., 2000).
Содержание сектированного гормона в ткани регулируется по трем различным
механизмам. Во-первых, большое количество циркулирующих глюкокортикоидов
связано с кортикостероид-связывающим глобулином и таким образом биологически
неактивно. Сходным образом, глюкокортикоиды могут связываться с сывороточным
альбумином, менее специфично, однако в большем количестве. Во-вторых,
активность глюкокортикодов напрямую зависит от действия 11-β-HSD (11-βгидроксистероид дегидрогеназа). Существует 2 основных фермента: 11-β-HSD типа I,
которая служит в основном для восстановления и активации глюкокортикоидов, и 11β-HSD типа II, которая катализирует переход активных глюкокортикоидов (кортизол
и кортикостерон) путем окисления в инертные 11-кетоформы (кортизон, 11дегидрокортикостерон) (Sandeep and Walker, 2001). Обе формы 11-β-HSD имеют
ткане-специфичные уровни экспрессии, что является важным аспектом для регуляции
содержания гормонов стресса. К примеру, в клетках-мишенях альдостерона, где
экспрессия 11-β-HSD II высока, уровни глюкокортикоидов значительно снижены
(Napolitano, Voice et al. 1998). В других тканях, таких как печень, жировая ткань и
мозг, активные глюкокортикоиды могут быть локально регенерированы
из
неактивных метаболитов действием 11-β-HSD типа I (Seckl and Walker, 2004). Помимо
11-β-HSD, доступ к специфичным органам, таким как мозг, контролирует
32
молекулярный насос, так называемый multi-drug resistant 1a P-glycoprotein pump в
составе гемато-энцефалического барьера (Meijer, de Lange et al. 1998).
Хотя липофильные стероиды способны легко пересекать плаценту, уровень
глюкокортикоидов у плода гораздо ниже, чем в материнском организме (Speirs et al.,
2004). Это возможно благодаря тому, что плацетарная 11-β-HSD II формирует барьер
материнским глюкокортикоидам, и лишь 10-20% из них в активной форме поступают
в плод (White et al., 1997). На видоспецифические процессы утилизации активных
форм глюкокортикоидов влияют специфические профили экспрессии плацентарной
11-β-HSD II
в онтогенезе.
У мышей наблюдается
значительное снижение
плацентарной экспрессии гена 11-β-HSD II в поздний эмбриональный период
(Murphy, Zakar et al. 2002), в то время как у крыс это происходит в ходе беременности
ещё позже (Waddell, Benediktsson et al. 1998). У человека, активность плацентарной
11-β-HSD II
увеличивается в ходе беременности (McTernan et al., 2001).
Дифференциальное распределение 11-β-HSD в мозге может быть ответственно за
различную степень связывания глюкокортикоидных рецепторов с ДНК в разных
отделах мозга, например, при сравнении гиппокампа с гиппоталамусом и миндалиной
(Moisan et al., 1990).
Источником повышенного уровня глюкокортикоидов у плода может быть
хронический стресс или гормонотерапия матерей (Jobe et al., 2009). Синтетические
дексаметазон и бетаметазон являются устойчивыми к действию 11-β-HSD II и они
легко пересекают плаценту (White, Mune et al. 1997; Meaney, Szyf et al. 2007), и время,
в течение которого эти гормоны находятся в плазме крови матери в достаточно
высоком содержании, является определяющим с точки зрения негативных влияний на
потомство (гибель зародышей, волчья губа, задержка роста у потомства) (Hansen et al.,
1999). В постнатальном периоде стрессорные воздействия повышают уровни АКТГ и
кортизола в крови новорожденных как за счёт эндогенной секреции этих гормонов,
так и в результате поступления этих гормонов с молоком матери (Edwards and
Burnham, 2001). К повышению уровня этих гормонов приводит и гормонотерапия в
раннем постнатальном онтогенезе (Jobe et al., 2009). Подкожное введение
кортикостерона крысам приводит к максимальным уровням в плазме через 25 минут
33
(а также в некоторых тканях и, например, в гипофизе), в то время как в мозге
максимальные уровни кортикостерона наблюдаются через 40 минут после инъекции,
при этом уровни эндогенного кортикостерона в различных регионах мозга
практически идентичны (Kitchener, Di Blasi et al. 2004; Droste, de Groote et al. 2008).
В основе как позитивных, так и негативных влияний глюкокортикоидов на
метаболизм и процессы развития лежат определенные молекулярно-биологические
механизмы, первой стадией реализации которых является взаимодействие гормона со
своими рецепрторами.
1.3.1. Рецепторы глюкокортикоидов
Влияние гормонов стресса на физиологические процессы реализуется через их
связывание с ядерными рецепторами, которые являются управляемыми лигандами
транскрипционными факторами (Meaney, Szyf et al. 2007). Гены, кодирующие
минералокортикоидные (MR) и глюкокортикоидные (GR) рецепторы, имеют сходную
организацию в геноме и оба состоят из 9 экзонов (Leonard, Godson et al. 2005).
GR и MR структурно близки к другим членам семейства стероидных рецепторов
(«класс
1»),
включающему
эстрогеновый,
прогестероновый
и
андрогеновый
рецепторы. У них обнаружены три главных структурных домена: N-концевой район,
центрально
расположенный
ДНК-связывающий
район
и
C-концевой
район,
содержащий лиганд-связывающий домен (Leonard, Godson et al. 2005). N-концевой
район наиболее вариабелен по размеру и аминокислотной последовательности. Он
несёт в себе лиганд-независимую активационную функцию и является платформой
для привлечения белков, ремоделирующих хроматин. Центрально-расположенный
ДНК-связывающий домен высоко консервативен среди родственных стероидных
рецепторов. Он обеспечивает специфичность распознавания гормон-отвечающих
элементов ДНК (van der Laan and Meijer, 2008). Лиганд-связывающий домен,
расположенный на C-конце, содержит карман для специфического связывания
соответствующего лиганда. Кристаллографические исследования показали, что
связывание лиганда индуцирует конформационные изменения в α-спирали, наиболее
близко расположенной к С-концу, и поверхность белка становится благоприятной для
34
его взаимодействия с транскрипционно активными белками, среди которых одними из
самых важных являются белки-корегуляторы транскрипции (Kumar and Chambon
1988; van der Laan and Meijer 2008).
Несколько альтернативных первых экзонов обнаружены для транскриптов и
минералокортикоидного, и глюкокортикоидного рецепторов, но так как первый экзон
– некодирующий для обоих генов, то различные транскрипты отличаются только 5’нетранслируемым районом (Patel et al., 1989). Различия этих изоформ мРНК, повидимому, влияют на стабильность транскриптов или эффективность трансляции,
либо они могут отражать дифференциальную регуляцию экспрессии различными
промоторами в разных тканях (van der Laan and Meijer, 2008).
У человека обнаружен единственный ген, кодирующий GR. Он расположен в 5ой
хромосоме (5q31) (Sionov et al., 2006b). GR классифицируют как ген домашнего
хозяйства, чья экспрессия находится под контролем GC-богатого промотора, в
котором отсутствуют консенсусные TATA- или CAAT- последовательности (Leonard,
Godson et al. 2005). Многие транскрипционные факторы ответствены за поддержание
базальной активности промоторов GR. Среди них SP1, AP-2, Ku70, Ku80 и Yin Yang 1
(Leonard, Godson et al. 2005). Благодаря функционированию различных промоторов
формируется пять мРНК транскриптов гена GR (1А-1E) (Breslin, Geng et al. 2001). 1А
транскрипт демонстрирует тканевую специфичность и в основном экспрессируется в
тимоцитах и в коре мозга, он вовлечен в глюкокортикоид-индуцируемый апоптоз
(Breslin, Geng et al. 2001). Хотя, благодаря альтернативному сплайсингу и различным
сайтам инициации транскрипции, у грызунов генерируются различные изоформы
мРНК GR (Sionov et al., 2006b), проапоптозная активность в основном преписывается
полной 94 Кда форме GRα, являющейся основным продуктом всех транскриптов
(Sionov et al., 2006a). У человека, в отличие от грызунов, ген глюкокортикоидного
рецептора имеет 3 альтернативных сплайс-варианта, которые дают два различных
типа мРНК и два разных белка: глюкокортикоидные рецепторы α и β. 50 С-концевых
аминокислотных остатков, заключающих в себе лиганд-связывающий карман,
отсутствуют у β-изоформы, что приводит к тому, что транскрипционный фактор
конститутивно находится в ядре. Установлено, что GRβ транскрипционно неактивен и
35
действует как доминантный негативный транскрипционный фактор (van der Laan and
Meijer, 2008).
У человека экспрессия гена MR контролируется двумя промоторами (P1, P2), а у
крыс как минимум тремя (MR-alpha, MR-beta, MR-gamma), с которых считываются
альтернативные транскрипты (Vazquez, Lopez et al. 1998). Наблюдаются вариации в
экспрессии и регуляции разных транскриптов MR в ходе развития и во взрослом
возрасте (Vazquez, Lopez et al. 1998; Rogalska, Kang et al. 2009).
Минерало- и глюкокортикоидные рецепторы имеют различные трансляционные
варианты, как следствие множественных функциональных последовательностей
Козака в их мРНК. Эти варианты, называемые например минералокортикоидными
рецепторами A, B и т.д., отличаются по своему влиянию на транскрипцию других
генов. Интересно, что эти трансляционные варианты также экспрессируются тканеспецифичным образом (Pascual-Le Tallec and Lombes, 2005).
Несмотря на свою схожесть, MR и GR зачастую по-разному влияют на
различные процессы в ЦНС. Эффекты глюкокортикоидов, осуществляемые через MR,
как
правило,
увеличивают
возбудимость
и
стабильность
функционирования
нейронных сетей, а активация GR приводит к отложенной супрессии некоторых
процессов, запущенных через MR (de Kloet, Fitzsimons et al. 2009). Указанные
особенности, во многом, определяются различиями в способности GR и MR к
привлечению разнообразных корегуляторов транскрипции, что приводит к различиям
в эффектах двух типов рецепторов на экспрессию генов (de Kloet et al., 2005).
Существуют
региональные
особенности
эффектов
глюкокортикоидов
на
функционирование нервных клеток, связанные с различиями в уровнях экспрессии
двух типов рецепторов в разных отделах мозга, и, следовательно, различной
величиной отношения экспресии GR/MR в них. В целом, GR экспрессируются в
большинстве тканей плода, начиная с ранних эмбриональных этапов (Speirs et al.,
2004), их экспрессия высока в плаценте (Meaney, Szyf et al. 2007).
В мозге GR экспрессируются повсеместно как в нейронах, так и в глиальных
клетках (de Kloet et al., 2005). Плотность GR наиболее велика в мелкоклеточных
паравентрикулярных ядрах гипоталамуса, в нейронах восходящих аминоэргических
36
путей, а также в нейронах лимбической системы, особенно в гиппокампе (Herman,
O'Halloran et al. 2003). В пирамидных нейронах гиппокампа, клетках латеральных ядер
перегородки и в некоторых областях коры совместно экспрессируются и MR, и GR (de
Kloet et al., 2005). MR значительно превосходят GR по содержанию в СА3-области
гиппокампа, а также в области перегородки (de Kloet et al., 2005).
1.3.2. Механизмы действия глюкокортикоидов
Как
было
сказано
филогенетически
выше,
родственными
глюкокортикоиды
ядерными
связываются
рецепторами
с
двумя
–
MR
(минералокортикоидный рецептор) и GR (глюкокортикоидный рецептор) (Woolley et
al., 1991). MR в 10 раз более эффективно связывают глюкокортикоиды, чем GR (Reul
and de Kloet 1985; Funder 1992). Поэтому MR на 80% заняты глюкокортикоидами даже
при базальных, низких уровнях гормонов, наблюдаемых в отсутствие стресса (Reul
and de Kloet, 1985). Они «отвечают» за установление базальной активности
гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой
системы
(Funder,
1992).
В
противоположность MR, GR находятся в спокойных, нестрессорных условиях, в
несвязанном состоянии и активируются только во время стресса, при высоких
концентрациях глюкокортикоидных гормонов (Woolley, Gould et al. 1991; Funder
1992).
В несвязанном с гормоном состоянии рецептор кортикостероидов находится в
цитоплазме в составе мультипротеинового комплекса из белков теплового шока
(hsp90, hsp70, hop, hsp 40 и p 23 (Leonard, Godson et al. 2005) и иммунофилинов
(Ricketson, Hostick et al. 2007). При связывании лиганда, рецептор диссоциирует из
этих комплесов, и конформационные изменения молекулы позволяют открыть
сигнальные
мотивы
белка,
необходимые
для
распознавания
транспортным
механизмом клетки (Hager et al., 2000). Члены семейства белков импортинов
направляют активированные лигандом рецепторы в каналы ядерной мембраны, через
которые производится транслокация рецепторов в ядро (van der Laan and Meijer, 2008).
Действие лиганд-активируемых стероидных рецепторов обычно ассоциировано со
стадией инициации транскрипции (Sabbah et al., 1998). MR и GR образуют
37
гомодимеры, траслоцируются в ядро, где взаимодействуют со специфическими
нуклеотидными последовательностями геномной ДНК – гормон-отвечающими
элементами (GRE), привлекают к месту своей посадки корегуляторы транскрипции
(de Kloet et al., 2005), обеспечивая тем самым, влияние на экспрессию близлежащих
генов (Meijer, Kalkhoven et al. 2005).
Белки-корегуляторы – это белки с ферментативной активностью, которые
реорганизуют хроматин после взаимодействия с лиганд-активируемым рецептором.
Корегуляторы подразделяют на коактиваторы и корепрессоры в зависимости от их
влияния на транскрипцию. Коактиваторы имеют гистон ацетилтрансферазную
активность, в то время как корепрессоры - гистон деацитилтрансферазную (van der
Laan and Meijer, 2008). При этом корегуляторы имеют специфичность к определенным
ядерным рецепторам (Meijer, Kalkhoven et al. 2005). К примеру, EF11-19LRL
(elongation factor eleven-nineteen lysine-rich leukemia) служит как коактиватор для
минералокортикоидного
рецептора,
но
как
корепрессор
глюкокортикоидного
рецептора (Pascual-Le Tallec and Lombes, 2005).
Состав
нуклеотидной
последовательности
и
GRE
его
фланкирующей
последовательности - это важнейшие характеристики для определения величины и
природы ответов на воздействие гормонов. Для минерало- и глюкокортикоидных
рецепторов экспериментально установлены консенсусные последовательности GRE.
Она состоит из двух палиндромных гексануклеотидных полусайтов, разделенных
спейсером из трех произвольных нуклеотидов. Каноническая последовательность
AGAACAnnnTGTTCT, но возможны и другие варианты (van der Laan and Meijer,
2008). Промотороные области генов-мишеней могут содержать один GRE или более, а
также добавочные полусайты. Глюкокортикоидные рецепторы связываются с
регуляторными
районами
разных
генов-мишеней
с
различной
степенью
специфичности. Это происходит благодаря тому, что, во-первых, последовательности
GRE могут отличаться у разных генов, а во-вторых, MR и GR способны
взаимодействовать
с
другими
транскрипцинными
факторами,
и
наборы
взаимодействующих факторов для двух различных генов могут значительно
различаться (van der Laan and Meijer, 2008).
38
В отличие от трансактивации, которая происходит путем взаимодействия
рецептора с гормон-отвечающими элементами генома (GRE), трансрепрессия
достигается за счет связывания с другими транскрипционными факторами или
связыванию с негативными GRE (nGRE) (Zhou and Cidlowski, 2005).
Негативные GRE (nGRE) были обнаружены в промоторных районах нескольких
генов, включая гены про-опиомеланокортина и кортикотропин-релизинг гормона,
двух основных пептидных гормонов гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси
(Malkoski and Dorin 1999). Непосредственное связывание лиганд-активируемых
глюкокортикоидных рецепторов с nGRE приводит к репрессии генов-мишеней (van
der Laan and Meijer, 2008). Механизм, с помощью которого глюкокортикоидный
рецептор, связавший свой агонист, способен опосредовать репрессию генов через
nGRE до сих пор не вполне понятен. Аллостерические изменения, которые
происходят после связывания глюкокортикоидного рецептора с nGRE, могут
способствовать
привлечению
корепрессоров
транскрипции
с
гистон-
деацетилтрансферазной активностью. Также возможно, что nGRE в промоторе
находится в непосредственной близости к элементу генома, связываемому другим
транскрипционным фактором, таким образом, что стерическая помеха препятствует
одновременному связыванию обоих транскрипционных факторов, что приводит к
снижению экспрессии гена (van der Laan and Meijer, 2008).
При связывании с гормон-отвечающими элементами генома происходит
димеризация глюкокортикоидных рецепторов, в то время как трансрепрессия путем
взаимодействия с другими транскрипционными факторами опосредована действием
мономеров рецептора (Heck, Kullmann et al. 1994). Прямое белок-белковое
взаимодействие с другими транскрипционными факторами, такими как AP-1 и NF-kβ,
снижает транскриционную активность этих факторов в промоторах их геновмишеней, при этом подобный эффект реализуется уже в первый час после введения
гормона (Morsink, Steenbergen et al. 2006). К тому же, глюкокортикоидные рецепторы
способны вызывать селективную репрессию экспрессии генов, влияя на промоторспецифические компоненты регуляторного комплекса NF-kβ (Luecke and Yamamoto
2005).
39
Глюкокортикоидные рецепторы взаимодействуют с различными сигнальными
каскадами, включая ERK-1/2 (extracellular signal-regulated kinase-1/2)-зависимый –
путем стимуляции экспрессии и синтеза de novo фосфатазы-1 MAPK (MPK-1 –
митоген-активируемой протеин киназы), что приводит к ингибированию данного пути
(Kassel,
Sancono
et
al.
2001).
Также
GR
стимулируют
экспрессию
гена
глюкокортикоид-индуцируемого лейцинового зиппера, что, в свою очередь, приводит
к ингибированию активности AP-1 (Mittelstadt and Ashwell 2001).
Влияние гормонов стресса иногда проявляется через столь короткие промежутки
времени, что оно не может быть обусловлено действием на экспрессию генов (Druilhe
et al., 2003). Возможным объяснением этих эффектов является то, что наряду с
описанным выше, «геномными» механизмами действия глюкокортикоидов, эти
гормоны, по-видимому, обладают быстрыми «негеномными» эффектами. Они
способны действовать через некоторые белки клеточной мембраны (например,
рецепторы ГАМК) (de Kloet et al., 2005). Такие эффекты также включают образование
активных
форм
кислорода
(reactive
фосфатидилинозитол-специфичной
oxygen
фосфолипазы
species
С
–
ROS);
(PI-PLC)
c
активацию
последующей
временной мобилизацией кальция; активацию кислой сфингомиелиназы, приводящей
к увеличению образования керамида, дефосфорилированию Bcl-2 и гибели клетки
(Sionov et al., 2006b); а также высвобождение катепсина B из лизосом (Druilhe, Letuve
et al. 2003; Wang, Muller et al. 2006).
Некоторые из быстрых эффектов глюкокортикоидов опосредованы протеин
киназами, диссоциирующими из рецепторных комплексов глюкокортикоидных
рецепторов
после
митохондриальную
связывания
мембрану
гормона,
(Sionov
et
другие
al.,
–
2006b).
транслокацией
GR
В
случае,
последнем
в
глюкокортикоидные рецепторы образуют комплексы с молекулами антиапоптозного
белка Bcl-2, способствуя их транслокации в митохондриальную мембрану. Низкие
дозы глюкокортикоидов стимулируют эту ассоциацию и транслокацию, а высокие
ингибируют,
что
приводит
к
антиапоптозному
действию
низких
доз
и
антиапоптозному - высоких. Важно отметить, что указанные механизмы быстрого
влияния глюкокортикоидов, не ассоциированные с изменением экспрессии генов,
40
несмотря на своё многообразие, вносят лишь незначительный вклад в регуляцию
процессов апоптоза в развивающейся ЦНС, в то время как подавляющее большинство
эффектов гормонов стресса реализуются путем изменения экспрессии белков
апоптозного каскада (de Kloet et al., 2005).
1.3.3. Эффекты глюкокортикоидов в ЦНС
Пренатальное
введение
высоких
доз
глюкокортикоидов
вызывает
многочисленные уродсва у лабораторных животных (Hansen et al., 1999). У
детенышей
макак-резусов
вследствие
действия
дексаметазона
наблюдается
значительная нейродегенерация (Uno et al., 1990) и нарушения процессов
формирования мозга (Jerome and Hendrickx, 1988), у грызунов приводит к
образованию волчьей губы (LaBorde et al., 1992), и препятствует сворачиванию
нервной трубки in vitro (Hansen and Grafton, 1994).
Пренатальный стресс и его гормоны глюкокортикоиды влияют на развитие
нейромедиаторных систем, вызывают в последующие периоды жизни нарушения
нейрохимии мозга, стрессорной реактивности, поведения (Naumenko, Dygalo, 1980;
Дыгало, 1993). Спровоцированное стрессом воздействие глюкокортикоидов на мозг
плодов крыс снижает нейрогенез в коре и гиппокампе, вызывает атрофию дендритов
нейронов гиппокампа, нарушает миграцию нейронов и способствует развитию
кортикальной дисплазии (Edwards and Burnham, 2001). Пренатальный стресс снижает
пролиферацию клеток гиппокампа в течение всей жизни. Более того, степень
выживаемости вновь образующихся клеток, число незрелых нейронов и число
дифференцированных новых нейронов были снижены как у молодых, так и у старых,
подвергнутых пренатальному стрессу, крыс (Lemaire, Lamarque et al. 2006).
Постнатальное введение дексаметазона недельным крысятам уменьшает массу их
мозга, снижает миелинизацию волокон ЦНС (Benesova and Pavlik, 1989). Гормоны
стресса ингибируют клеточную пролиферацию у молодых (Gould et al., 1992) и
стареющих крыс (Montaron et al., 1999), и снижают выживаемость нервных клеток у
молодых крыс (Lemaire, Lamarque et al. 2006). Последствия нейротоксических
эффектов глюкокортикоидов в онтогенезе зависят от циркадианных ритмов (Sauerbier,
41
1987), влияния витаминов (Natsume et al., 1986), уровней рецепторов гормонов (Gupta
and Goldman, 1982), а также от эффективности функционирования механизма
отрицательной обратной связи в составе ГГНС (Dupouy et al., 1987).
Кортикостерон увеличивает, а дексаметазон снижает содержание GR в ядрах
клеток гиппокампа, гипоталамуса, префронтальной коры, миндалины и гипофиза
(Spiga and Lightman 2009).
Влияние глюкокортикоидов на мозг может быть также связано с их действием на
экспрессию BDNF. Эти гормоны (Nicholas, Munhoz et al. 2006) и хронический стресс
(Duman and Monteggia, 2006) снижают уровни мРНК и белка BDNF (mat-BDNF+proBDNF) во взрослом мозге (Schaaf, Sibug et al. 1999), в особенности, в гиппокампе
(Adlard and Cotman, 2004; Bravo et al., 2009; Fuchikami et al., 2009; Hossain et al., 2008).
Эти
изменения
можно
обнаружить
через
6-8
часов
после
повышения
глюкокортикоидов в крови (Hansson, Sommer et al. 2006). У неонатальных крыс,
лишенных контакта с матерью, что является для них сильным стрессором,
существенно повышающим уровень глюкокортикоидов в крови, снижение уровня
мРНК BDNF в гиппокампе может наблюдаться даже через 4 недели после воздействия
(Choy, de Visser et al. 2008). Однако данные об эффектах глюкокортикоидов и стресса
на нейротрофины противоречивы. Например, было показано увеличение экспрессии
NGF и NT-3 при отсутствии изменений в уровне BDNF под влиянием кортикостерона
(Barbany and Persson, 1992). Более того, имеется свидетельство значительного
повышения у приматов уровня BDNF в гиппокампе, в особенности в CA3 области и
зубчатой извилине, в результате хронического воздействия кортизолом (McMillan and
Herbert, 2004). К тому же, острый стресс, в отличие от хронического, приводит к
кратковременному увеличению экспрессии BDNF в гиппокампе взрослых крыс
(Bulygina et al., 2011; Shi et al., 2010). Через 60 минут после стресса у них в гипофизе
также регистрируются увеличенные уровни мРНК и белка BDNF, а через 180 и 300
минут их уровни там уже снижены (Givalois, Marmigere et al. 2001).
Не исключено, что действие гормонов стресса на экспрессию мозгового
нейротрофического фактора может быть результатом их влияния на активность
промотора некодирующего экзона VI гена BDNF. После акустической стимуляции
42
взрослых животных, которым перед этим вводили дексаметазон, уровень активации
этого экзона в паравентрикулярных ядрах гипоталамуса был значительно ниже, чем у
животных, которым дексаметазон не вводили, а снижение уровня эндогенных
глюкокортикоидов вследствие адреналэктомии активировало экспрессию экзона VI
гена BDNF (Hossain, Hajman et al. 2008).
Введение гормонов стресса, снижающее экспрессию BDNF, усиливает гибель
нейронов гиппокампа, вызванную лишением их внешних источников трофических
факторов (Nitta, Ohmiya et al. 1999). В то же время, экзогенный BDNF ослабляет
гибель клеток гиппокампа у взрослых животных, вызванную высокими дозами
кортикостерона, и этот эффект нейтрализуется блокатором TrkB (Nitta, Ohmiya et al.
1999). По всей видимости, причина повреждения кортикостероном нейронов
гиппокампа, по крайней мере, частично, кроется в снижении в них синтеза BDNF
(Nitta, Ohmiya et al. 1999). Вместе с тем, повышение глюкокортикоидами экспрессии
Trk рецепторов оказывает прямо противоположное, нейропротективное действие
(Jeanneteau, Garabedian et al. 2008). Однако, действуют ли подобные механизмы в
формирующемся мозге, остается неясным.
1.3.3.1. Влияние глюкокортикоидов на процессы апоптоза
Эффекты глюкокортикоидов на формирующийся мозг могут быть связаны и с их
непосредственным влиянием на программируемую гибель клеток. Глюкокортикоиды
способны индуцировать апоптоз, напрямую регулируя как внешний, так и внутренний
пути апоптоза (Herr et al., 2007). Эти гормоны индуцируют апоптоз клеток многих
периферических тканей: лимфоцитов, эозинофилов, миобластов и остеобластов (Chae,
Chae et al. 2000), остеоцитов (Weinstein et al., 2000), хондроцитов (Chrysis, Zaman et al.
2005). В лимфоидных тканях происходит увеличение экспрессии различных изоформ
проапоптозных белков Bim и Puma и снижение экспрессии антиапоптозного гена cMyc, повышается экспрессия глюкокортикоид-индуцируемого лейцинового зиппера,
ингибитора NF-kB – IkB, гена ассоциированного с гибелью T-клеток (tdag8),
тиоредоксин-связывающего
белка
(txnip)
глюкокортикоидов (Sionov et al., 2006b).
и
гранзима
А
под
влиянием
43
В мозге введение дексаметазона интенсифицирует апоптоз клеток гиппокампа
взрослых крыс, а также стволовых клеток этой структуры мозга (Haynes, Griffiths et al.
2001). Стресс, сопровождаемый увеличением уровня глюкокортикоидов, снижает
пролиферацию и увеличивает апоптоз клеток гиппокампа (Heine, Maslam et al. 2004).
Индуцированное стрессом воздействие глюкокортикоидов на мозг плодов крыс
активирует апоптоз в паравентрикулярных ядрах гипоталамуса и приводит к потере
части их нейронов (Welberg, Seckl et al. 2001). Повышение уровня кортикостерона у
неонатальных крысят приводит к увеличению числа TUNEL-позитивных клеток в
коре мозга и мозжечке (Zhang, Levine et al. 2002). Но глюкокортикоиды также могут
выступать в качестве супрессоров гибели клеток в некоторых органах, тканях и
опухолях
(Costas et al., 2000). Одним из
главных
механизмов подобных
разнонаправленных эффектов гормонов стресса на гибель клеток различных тканей
является их влияние на уровни экспрессии генов, связанных с процессом апоптоза
(Sionov et al., 2006b).
В настоящее время предполагается, что одной из причин различия эффектов
глюкокортикоидов и их аналогов на ПКГ в мозге могут являться неодинаковые
функции каждого из двух типов рецепторов этих гормонов в регуляции апоптоза. MR
считают
ответственными
глюкокортикоидов
за
(Crochemore,
анти-,
Lu
а
et
GR
al.
–
за
2005).
проапоптозные
Блокатор
GR
эффекты
рецепторов
предотвращает потерю клеток в гиппокампе, индуцированную механическим
повреждением (McCullers, Sullivan et al. 2002). MR и GR влияют на экспрессию в
мозге некоторых про- и антиапоптозных генов (Nair et al., 2004), как например
антиапоптозного Bcl-2 (Rogalska, Kang et al. 2009). Стимуляция MR в гиппокампе
изменяет баланс мРНК белков Bcl-2 семейства в пользу антиапоптозных, а
стимуляция GR смещает это соотношение в пользу проапоптозных белков (Almeida,
Conde et al. 2000). Активация MR ингибирует и пролиферацию, и апоптоз клеток в
зубчатой извилине гиппокампа взрослых крыс (Hu et al., 1997). В гиппокампе у
адреналэктомированных животных наблюдается снижение уровней как анти-, так и
проапоптозных белков Bcl-2 семейства, так как и MR, и GR у них лишены своего
эндогенного активатора (Nair et al., 2004). К тому же, MR и GR неодинаково влияют
44
на чувствительность к нейротрансмиттерам в пирамидальных нейронов (Kodama,
Shimizu et al. 2003), что также может приводить к различным последствиям для клеток
с точки зрения их склонности к программируемой гибели.
В целом, имеющиеся в литературе данные, свидетельствующие о критически
важных событиях в формировании мозга в неонатальный период онтогенеза,
оставляют, однако открытыми вопросы как о механизме действия глюкокортикоидов
на апоптоз, так и о способности этих гормонов регулировать экспрессию белков
нейропластичности в развивающемся головном мозге млекопитающих. Следует также
отметить и то, что препараты
медицинской
практике
для
глюкокортикоидов
коррекции
ряда
широко используются
патологических
в
состояний
новорожденных, таких как респираторный дистресс-синдром, сопровождаемый
гипоксией
тканей
мозга (Baud and Sola, 2007). Таким образом, эффекты
глюкокортикоидов тесно переплетены с последствиями гипоксии, и необходимо
учитывать вклад обоих этих факторов при рассмотрении их влияния на апоптоз в
развивающемся мозге.
1.4. Эффекты гипоксии на процессы апоптоза в развивающейся нервной системе
Гипоксия новорожденных – это часто встречающееся и нередко очень опасное
состояние, требующее вентиляции лёгких, кислородную терапию, кортикостероиды и
другие поддерживающие процедуры (Bruder, Taylor et al. 2008; Tin and Wiswell 2008).
Она может развиваться вследствие недоразвития легких при преждевременных родах,
а также при различных сердечно-легочных патологиях, таких как открытый
артериальный проток (Low et al., 1993). Также гипоксия у детей может иметь место в
результате остановки дыхания, респираторных инфекций и других патологических
состояний (Hermansen and Lorah 2007; Bruder, Taylor et al. 2008).
Считается, что неонатальный мозг более устойчив к гипоксии, чем мозг взрослых
особей (Nyakas et al., 1996). Однако, перинатальная асфиксия вызывает необратимые
повреждениям мозга вследствие клеточной гибели нейронов в регионах мозга,
чувствительных к недостатку кислорода, в особенности в гиппокампе (Nyakas,
Buwalda et al. 1996; Berger and Garnier 1999).
45
1.4.1. Молекулярные механизмы влияния гипоксии
Основной причиной «разрушительности» эффектов гипоксии является то, что
клетки в организме млекопитающих не способны после воздействия гипоксии
удовлетворять энергетические потребности своих активных ион-транспотирующих
систем, что приводит к истощению субстратов ферментов, разрушению клеточных
мембран и гибели клеток (Boutilier 2001; Zhu, Li et al. 2010). За адаптивный ответ на
гипоксию ответственен, среди прочих, транскрипционный фактор индуцируемый
гипоксией (HIF-1) (Chavez and LaManna 2002). Он регулирует, в частности,
экспрессию эритропоэтина, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), основного
фактора
роста
фибробластов
(bFGF),
которые,
в
свою
очередь,
обладают
нейропротективными эффектами (Taoufik and Probert, 2008).
Гипоксия-индуцируемый фактор-1 (HIF-1) – это гетеродимерный белок,
состоящий из α- и β-субъединиц. В то время как β-субъединица конститутивно
представлена в клетках, α-субъединица высоко чувствительна к кислороду и в его
присутствии немедленно гидроксилируется по специфическим остаткам пролина и
аспарагина (Kodama, Shimizu et al. 2003; Wagner, Huck et al. 2008). α-субъединица,
гидроксилированная по остатку пролина распознается и связывается белком вон
Хиппель-Линдау (von Hippel–Lindau protein), который является частью E3 убиквитинлигазного комплекса. Впоследствии, HIF-1α подвергается полиубиквитинилированию
и деградации протеасомой (Ivan, Kondo et al. 2001). Эти посттрансляционные
модификации ингибируются в гипоксических условиях, приводя к стабилизации
уровня белка HIF-1α, накоплению HIF-1 в ядре и его связыванию с гипоксияотвечающим
элементом
(HRE)
(5’-RCGTG-3’)
генома.
HRE
впервые
были
обнаружены в 3’-энхансерном районе гена эритропоэтина, а позднее и в
промотороных
районах
генов
фактора
роста
эндотелия
сосудов
(VEGF),
транспортеров глюкозы (GLUT) и адреномедуллина (ADM) (Huang and Bunn, 2003).
Гипоксия индуцирует функционирование трансактивацивационных доменов HIF-1α и
усиливает их способность к взаимодействию с белками-коактиваторами транскрипции
(Lando, Peet et al. 2002). В результате трансактивации подвергаются гены,
46
вовлеченные в гликолиз, ангиогенез, вазодилятацию, в их числе фосфофруктокиназа,
ADM, VEGF (Matherne et al., 1990).
Ишемические повреждения или гипоксия вызывают увеличение экспрессии HIF1 (Keilhoff, Schild et al. 2008), что может говорить о защитном действии этого белка в
клетке при гипоксических состояниях. Однако, несмотря на непосредственную связь
действия HIF-1 с гипоксией, этот белок не является обязательным для адаптации
клетки к гипоксии; к тому же, он вовлечен в воспалительные процессы и заживление
ран (Wagner et al., 2008).
Помимо HIF, в мозге грызунов в регуляции адаптивного ответа на гипоксию
могут принимать участие до 14 семейств транскрипциооных факторов и ещё большее
число молекулярных каскадов, в реализацию которых непосредственную роль играют,
к примеру, инсулин-подобные факторы роста и рецепторы глюкокортикоидов (Xu, Lu
et al. 2011).
Гипоксия способна вызывать апоптоз клеток различных типов. Так, в
культивируемых клетках мозжечка неонатальных крысят долгосрочная кислородноглюкозная депривация приводит к цитотоксическим эффектам вплоть до нескольких
суток после воздействия. Однако, данные по стимуляции апоптоза гипоксией
несколько противоречивы: показано, что гипоксия с последующей реоксигенацией
стимулирует выживание и пролиферацию клеток различных типов (Sung, Jung et al.
2007; Zhu, Li et al. 2010).Механизмы влияния на выживаемость нервных клеток могут
быть связаны с гипоксия-индуцированными изменениями в них экспрессии про- и
антиапоптозных генов. В культуре гиппокампа in vitro гипоксия стимулирует
экспрессию гена bcl-x по NF-kB-зависимому механизму (Glasgow et al., 2001).
Напротив, в коре мозга взрослых крыс линнии Sprague-Dawley гипоксемия, вызванная
механическим повреждением мозга, приводит к снижению уровня антиапоптозного
белка Bcl-2 на фоне неизменной экспрессии проапоптозного Bax и антиапоптозного
Bcl-XL (Vlodavsky, Palzur et al. 2005). На культурах Шванновских клеток показано,
что гипоксия способствует активации каспазы-3, таким образом способствуя запуску
программы апоптоза (Zhu, Li et al. 2010). Аналогичное увеличение активности и
экспрессии каспазы-9 и каспазы-3 наблюдается вследствие гипоксии в коре мозга
47
новорожденных поросят (Nunez et al., 1998). Помимо белков апоптоза, гипоксия
способна приводить к значительному снижению уровней мРНК BDNF в Шванновских
клетках, при этом повышая уровень мРНК NGF. Она снижает секрецию BDNF, не
изменяя при этом секрецию NGF (Zhu, Li et al. 2010). Представленные выше сведения
свидетельствуют о неоднозначном влиянии гипоксии на экспрессию белков,
ассоциированных с программой апоптоза нервных клеток, в зависимости от
сопутствующих условий и клеточных популяций, и необходимости детального
выяснения
эффектов
гипоксического
воздействия
в
развивающемся
мозге
млекопитающих.
1.4.2. Совместное влияние гипоксии и глюкокортикоидов на апоптоз в ЦНС
Респираторный дистресс-синдром (РДС) новорожденных, характеризующийся
недостаточностью созревания сурфактанта в альвеолах легких, угрожает летальным
исходом и вызывает асфиксию, которая приводит к необратимым повреждениям мозга
вследствие клеточной гибели нейронов в регионах мозга, чувствительных к
недостатку кислорода (Berger and Garnier, 1999). Терапия глюкокортикоидами,
используемая для коррекции РДС, оказывает ряд отрицательных влияний на
формирующийся
мозг
(Nyakas
et
al.,
1996),
которые
нередко
связаны
с
интенсификацией физиологического апоптоза нервных клеток (Zuloaga, Carbone et al.
2012). При этом подобную терапию, в зависимости от врачебных показаний, проводят
как до родов – матери, так и после – новорожденному (Jobe et al., 2009).
В
целом,
адаптация
к
гипоксии
находится
под
влиянием
ГГНС
и
глюкокортикоидов. К примеру, уровень кортизола в плазме крови увеличивается из-за
увеличения секреции АКТГ на больших высотах или при внутриутробных
гипоксических условиях (Gardner et al., 2001), при этом профилактическое введение
синтетических глюкокортикоидов эффективно предотвращает «высотную слабость»
(Johnson et al., 1984). Исследования гипофизарно-надпочечникового ответа на
гипоксию (5% O2 в течение 20 минут) выявили отсутствие изменений уровня АКТГ в
плазме крысят вплоть до 14 дня жизни, в то же время, уровень кортикостерона в
плазме крови в ответ на гипоксию имеет U-образный, возраст-зависимый профиль
48
(PD2-PD21) (Walker et al., 1986). Неоднократно показано, что увеличение уровня
гормонов стресса в плазме крови в случае патологий, связанных с гипоксией, может
приводить либо к терапевтическим (Lafleur et al., 2003), либо к усугубляющим
последствиям (Roberts, Moore et al. 2004), в зависимости от времени относительно
установления патологического состояния. У пациентов после инсульта в крови
наблюдаются повышенные уровни кортизола, что зачастую является маркером
негативных последствий (Zhu, Gao et al. 2011). У 4-6-дневных крысят, подвергнутых
предварительно эпизоду гипоксии, дексаметазон вызывает заметное увеличение
экспрессии мРНК проапоптозного гена Bnip3 в нейронах коры мозга через 3-е суток
после введения гормона (Sandau and Handa 2007). В то же время, гипоксияиндуцируемое
увеличение
уровня
глюкокортикоидов
в
плазме
крови
у
новорожденных может способствовать закрытию артериального протока и созревания
сурфактанта в легких, повышает вазоконстрикторные ответы на циркулирующие
катехоламины (Deruelle, Houfflin-Debarge et al. 2003). У взрослых грызунов введение
глюкокортикоидов значительно снижает степень повреждения ткани мозга вследствие
ишемии (Dardzinski, Smith et al. 2000), а стресс-индуцируемый эритропоэз в условиях
гипоксии зависит от влияния глюкокортикоидов (Bauer, Tronche et al. 1999).
По-видимому, один из механизмов влияния глюкокортикоидов на процессы
адаптации к гипоксии может быть связан с изменением содержания и функции
гипоксия-индуцируемого фактора-1 в клетках. В культуре гепатомы человека
дексаметазон увеличивает уровни HIF-1α в цитозоле, и при этом снижает уровень
HIF-1α в клеточном ядре, а также снижает степень связывания HIF-1 с ДНК (Wagner et
al., 2008). В условиях гипоксии глюкокортикоиды через GR стимулируют HIF-1зависимую экспрессию генов. Интересно, что при действии через MR подобных
эффектов гормонов стресса не наблюдается (Kodama, Shimizu et al. 2003). Другие
стероидные
рецепторы
также
не
вызывают
подобной
стимуляции,
и
она,
предположительно, происходит благодаря непосредственному взаимодействию между
GR и трансактивационным доменом HIF-1α. Необходимость наличия агониста GR
указывает на важность лиганд-опосредованных конформационных изменений GR.
Лиганд-связывающий домен GR необходим для стимулирования HIF-1-зависимой
49
транскрипции, но ни связывание GR с ДНК, ни трансактивация не являются
необходимыми (Kodama, Shimizu et al. 2003).
Показано также, что эффекты гипоксии напрямую ассоциированы с изменениями
глюкокортикоидной сигнализации. У неонатальных (2 дня) крысят гипоксия сама по
себе и другие факторы, индуцируемые гипоксией (к примеру, катехоламины), в
надпочечниках
увеличивают
поглощение
холестерина,
и
усиливают
синтез
кортикостерона (Bruder, Taylor et al. 2008). Химическая гипоксия с использованием
антимицина A снижает экспрессию 11-β-HSD типа II на транскрипционном уровне
(Leonard, Godson et al. 2005). В гиппокампе взрослых крыс и человека гипоксия
повышает экспрессию MR (Rogalska, 2009). В клетках эпителиального ряда отмечено
транскрипционно-обусловленное увеличение экспрессии белка GR в ответ на
гипоксию, предположительно, обусловленное связыванием HIF-1 с одним или
несколькими HRE-сайтами в гене GR (Leonard, Godson et al. 2005), а базальные уровни
активности GRE при гипоксии выше, чем при нормоксии, что, вероятнее всего,
связано с увеличением экспрессии GR (Leonard, Godson et al. 2005). Вследствие
гипоксии также происходит стимуляция глюкокортикоид-зависимой трансрепрессии:
предварительное
воздействие
гипоксии
вызывает
усиление
вызванного
дексаметазоном ингибирования экспрессии VEGF (Leonard, Godson et al. 2005).
Процессы глюкокортикоид-зависимого апоптоза некоторых типов клеток также
зачастую
подвержены
стимулирующим
влияниям
гипоксии.
Так,
гипоксия
значительно усиливает вызванный дексаметазоном апоптоз остеобластов (Zhu, Gao,
2011). При этом введение кортикостерона и дексаметазона само по себе не вызывает
изменений, однако значительно усиливает цитотоксические эффекты, вызванные
кислородно-глюкозной депривацией (Zhu, Gao, 2011).
Данные литературы свидетельствуют о том, что и гипоксия, и гормоны стресса
способны изменять склонность нейрональных клеток к вступлению в апоптоз в
зависимости от региона мозга, возраста и порядка приложения воздействий. Однако
неясными остаются механизмы подобного влияния этих факторов. По этой причине,
целью нашей работы стало исследование влияний глюкокортикоидов и гипоксии на
50
экспрессию белков апоптозного каскада в отделах мозга неонатальных крысят и
выяснение этих эффектов в зависимости от порядка приложения воздействий.
51
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Животные и экспериментальные воздействия
2.1.1. Животные
В экспериметах использовали крыс линии Вистар, содержащихся в стандартных
условиях вивария ИЦиГ СО РАН: при температуре 22-24°С, естественном освещении
и свободном доступе к воде и корму. Для получения самок с датированным сроком
беременности ссаживали 3-х самок и 1-го самца. Первым днем беременности считался
день обнаружения спермы во влагалищном мазке. Покрытых в один день самок
рассаживали по 3 особи в клетку, а после 18-го дня беременности – по одной. День
родов принимался за первый день жизни крысят. В работе использовались 3- и 8дневные животные.
2.1.2. Введение гормонов
Введение дексаметазона. В работе использовали препарат синтетического
аналога глюкокортикоидов – дексаметазона (Krka, Словения). Препарат гормона в
дозе 0.2 мг/кг веса в 0.02 мл физиологического раствора вводили подкожно
однократно 3-дневным животным за 6, 10, 24 или 120 часов до забоя, 8-дневным
животным – за 6 часов до забоя.
Введение гидрокортизона. В работе использовали препарат глюкокортикоидного
гормона «Гидрокортизон-Рихтер» («Hydrocortisone-Richter», «Гедеон Рихтер А.О.»,
Венгрия). Препарат гормона в дозе 5 мг/кг в 0.02 мл физиологического раствора
вводили подкожно однократно 3- или 8-дневным животным за 6 часов до забоя.
Контрольным животным вводили физиологический раствор или оставляли
интактными.
Для
оценки
эффективности
введенных
доз
препаратов
глюкокортикоидов, использованных в работе, определяли прирост массы тела
животного относительно контроля. Хорошо известно, что использованные дозы
52
препаратов, эквивалентные применяемым в клинике, вызывают задержку роста
неонатальных крысят.
2.1.3. Моделирование гипоксического состояния
Гипоксическое состояние создавали у 3-дневных крысят за 6, 10 или 22 часа до
забоя. Крысят помещали в пластиковую камеру, которая непрерывно наполнялась
100% азотом и содержали в ней 15 минут при температуре 33-35°С.
После содержания в аноксических условиях животных помещали в атмосферу
воздуха и содержали при температуре 30°С. Контрольные животные находились в
камерах наполненных атмосферным воздухом при 33-35°С в течение 15 минут, а
затем содержались на воздухе вместе с животными, подвергнутыми гипоксии.
Проявление гипоксического состояния животных, вызванного их нахождением в
аноксических условиях, оценивали по прекращению активного передвижения и по
характерным дыхательным движениям в ходе содержания в камере, наполненной
азотом. Такой способ моделирования гипоксического состояния у неонатальных
животных был впервые применен более 20 лет назад (Dell’Anna et al.,1991), и с тех
пор широко используется в исследованиях с различными модификациями. При этом
использованный в нашей работе 15-минутный временной интервал нахождения в
аноксических условиях позволяет добиться заметных эффектов гипоксии на
метаболизм, экспрессию белков и поведение, однако не приводит к значительному
увеличению процента летальных исходов, в отличие от 20-минутной аноксии (Mach et
al., 2009).
В эксперименте по изучению эффектов гипоксии и дексаметазона животные
были разделены на 7 экспериментальных групп: (1) контроль – интактные животные, а
также животные, которым вводили физ. раствор за 6 или 10 ч до забоя; (2) животные,
подвергнутые эпизоду гипоксии за 10 ч до забоя; (3) животные, которым вводили
дексаметазон за 6 ч до забоя; (4) животные, подвергнутые эпизоду гипоксии за 10 ч и
инъецированные дексаметазоном за 6 ч до забоя; (5) животные, которым вводили
дексаметазон за 10 ч до забоя; (6) животные, подвергнутые эпизоду гипоксии за 6 ч до
забоя; (7) животные, инъецированные дексаметазоном за 10 ч и подвергнутые эпизоду
53
гипоксии за 6 ч до забоя. Группы 2, 3, 4 соответствовали постгипоксическому
введению дексаметазона; группы 5, 6, 7 – предгипоксическому.
2.2. Выделение образцов ткани мозга
Животных забивали путем быстрой декапитации на 3-й, либо на 8-ой дни жизни.
Головной мозг выделяли на холоду. У крысят выделяли гиппокамп, мозжечок,
стволовую часть их мозга, включающую продолговатый мозг и область моста – весь
объем ткани каудальнее задних бугров четверохолмия и ростральнее овального
отверстия без мозжечка, а также фронтальную кору, которая включала фронтальную
половину верхней поверхности полушарий толщиной 1.5-3.0 мм (Рис. 1). Образцы
ткани до выделения из них тотальных РНК и белка хранили в металлических
контейнерах при температуре жидкого азота.
Рис. 1. Диссекция мозга. На схеме отмечены отделы мозга, материал которых забирался для
анализа экспрессии белков.
54
2.3. Выделение РНК*
Выделение РНК проводили одностадийным гуанидин-изотиоцианатным методом
(Chomczynski and Sacchi, 1987). Ткань мозга гомогенизировали в 5 объемах,
относительно веса образца, охлажденного лизирующего буфера, содержащего 4М
гуанидинизотиоцианат,
0.7М
цитрат
натрия
(pH
7.0),
10%
саркозил,
2-β-
меркаптоэтанол, 2М ацетат натрия (pH 4.3), водонасыщенный фенол (pH 4.0),
хлороформ. Смесь встряхивали 3 минуты, охлаждали 15 минут на льду, затем 15
минут центрифугугировали (10000g, 4°С). Осаждение РНК из водной фазы проводили
изопропанолом при -20°С в течение ночи с последующим центрифугированием
(14000g, 4°С, 20 минут). Полученный осадок дважды промывали 75% этанолом,
однократно – 96% этанолом, затем растворяли в автоклавированной деионизованной
воде (mQ). Раствор суммарной РНК хранили при -65°С до получения кДНК.
Концентрацию РНК и степень её очистки от белков определяли на
спектрофотометре Bio-Rad при длинах волн: 260 и 280 нм. Соотношение оптической
плотности на длинах волн 260/280 нм, равное 1,8–2, считалось приемлемым для
дальнейшей работы с препаратами РНК (Маниатис, 1984).
2.4. Получение кДНК
3-5 мкг суммарной РНК каждого образца инкубировали 90 мин при 42 оС в 20
мкл смеси, содержащей 50U ревертазы MuLV («СибЭнзим», Россия), 5 мкМ
Oligo(dT)15 праймера, 1.5 мМ каждого dNTP, 1× буфер (50 мМ Tris-HCl (pH 8.3), 3 мМ
MgCl2, 75 мМ KCl, 10 мМ DTT). Перед началом реакции смесь РНК, Oligo(dT)15
праймера и воды прогревали при 70оС в течение 10 мин. По окончании инкубации
фермент инактивировали нагреванием до 70оС в течение 10 мин. Образцы кДНК
хранили при -65оС. Для ПЦР кДНК разводили в 25 раз.
* - Разделы 2.3., 2.4 и 2.5 выполнены соместно с с.н.с. Т. С. Калининой.
55
2.5. Оценка уровней мРНК белка Bcl-XL методом полимеразной цепной
реакции в реальном времени (real-time PCR)
Количественный анализ изменения содержания мРНК белка Bcl-XL в стволе
мозга 3-дневных крысят проводили методом ПЦР в реальном времени (real-time PCR)
с использованием наборов TaqMan® Gene Expression Assays на амплификаторе AB
Prism 7000 (“Applied Biosystems”, США). Все используемые для Real-time PCR
компоненты были приобретены в компании Applied Biosystems, США.
Амплификацию проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей
1×TaqMan® Universal PCR Master Mix, 1×TaqMan® Gene Expression Assays и 2,5 мкл
кДНК в стандартных 96-луночных оптических плашках. Дизайн праймеров, по
заявлению производителей, исключал возможность амплификации геномной ДНК.
Пробы TaqMan® имели флуоресцентный краситель FAM на 5'-конце и
нефлуоресцентный гаситель BHQ на 3'-конце, а также группу связывания с малой
бороздкой ДНК.
Режим реакции включал: 10-минутный прогрев при 95ºС для активации
полимеразы и последующие 40-45 циклов: 15 сек денатурации при 95ºС и 60 сек
инкубации при 60ºС. В соответствии с рекомендациями Applied Biosystems, уровень
пороговой флюоресценции выбирался управляющей программой (SDS, version 1.2.3)
автоматически. Все определения проводились минимум в двух повторах для каждого
образца кДНК, полученных от 5-6 животных. Коэффициент вариации для одной пробы
составлял менее 3%, корреляция между повторными определениями достигала 0.99.
Кинетические кривые ПЦР последовательных двукратных разведений кДНК от
50 до 6.25 нг, исходя из концентрации взятой РНК, для β-актина, используемого в
качестве контрольного, и Bcl-X представлены на Рис. 2 (А, Б). Кинетические кривые
пересекали линию пороговой флюоресценции для исследуемых генов в строгой
зависимости от количества внесенной кДНК.
Коэффициент линейной регрессии кинетических кривых для β-актина и Bcl-X в
координатах «Пороговый цикл (С(T)) – логарифм количества субстрата» выявил
достаточно близкую к теоретически возможной эффективность амплификации для
исследуемых генов (Рис. 3А). Разница между значениями порогового цикла для βактина и Bcl-X оставалась практически постоянной при использованных
концентрациях кДНК (Рис. 3Б).
Близкие значения эффективности ПЦР для целевого гена и генов, используемых
в качестве эндогенного контроля, позволяют проводить количественную оценку
исходной концентрации матрицы по разнице между значениями порогового цикла для
целевого и контрольного гена в широком диапазоне количества внесенной кДНК.
56
A
Пороговый
уровень
флуоресценции
флуоресценции
Ст
1 2 3 4
Базовый
уровень
флуоресценции
флуоресценции
Б
Пороговый
уровень
флуоресценции
флуоресценции
Ст
1 2 3 4
Базовый уровень
флуоресценции
Рис. 2. Кинетические кривые ПЦР в зависимости от количества внесенной в реакционную
смесь кДНК для β-актина (А) и Bcl-XL (Б).
1 - 50 нг, 2 - 25 нг, 3- 12.5 нг, 4 – 6.25 нг кДНК
57
А
Bcl-XL
actin
30
y = -3.37x+32.4
CT
28
26
24
y = -3.55x+26.9
22
20
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
Log cDNA
Б
12
11
Delta CT
y = 0.02x+9.63
10
9
8
7
6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
Log cDNA
Рис. 3. Определение условий проведения ПЦР в реальном времени.
(А) Зависимость величины порогового цикла (Ст) от логарифма количества субстрата и
уравнения линейной регрессии для генов Bcl-XL и β-актина.
(Б) Зависимость разности пороговых циклов между Bcl-XL и β-актином от логарифма
количества добавленного субстрата.
58
2.6. Выделение суммарного белка и его разделение посредством одномерного
денатурирующего гель-электрофореза
Выделение суммарного белка производили путем механической гомогенизации
в лизирующем буфере, содержащем 150 mM NaCl, 50 mM трис-HCl (pH 7,4), 1%
тритона X-100, 1 mM PMSF и по 1 мкг/мл леупептина, пепстатина и апротинина.
Образцы ткани гомогенизировали в 10 объемах (относительно веса образца)
охлажденного лизирующего буфера, полученные гомогенаты держали на льду в
течение 20 минут, а затем центрифугировали 20 минут (12000 g, 4°С). Концентрацию
суммарного белка в супернатанте определяли на спектрофотометре SmartSpec Plus
(Bio-Rad Laboratories, inc.) по Лоури (длина волны 750 нм), в качестве калибровочного
стандарта использовали бычий сывороточный альбумин (фракция V) (Lowry et al.,
1951). Супернатант хранили при –60°С до дальнейшего использования.
Аликвоты суммарного белка (50 мкг) денатурировали в буфере для нанесения
(50 mM трис-HCl, pH 6,8, 10% глицерина, 100 mM 2-β-меркаптоэтанола, 1% SDS,
0,002% бромфенолового синего) в течение 5 минут при 95°С. Разделение суммарного
белка производили посредством одномерного электрофореза в 12% (GR), 15% (для
Bcl-XL, Bax, активной и интактной каспазы-3) и 16,5% (для mat-BDNF и pro-BDNF)
SDS-полиакриламидном геле (система MiniProtean Tetra Cell, Bio-Rad Laboratories,
США) при постоянном напряжении 180 V. Белки, разделенные электрофоретически,
переносили с геля на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad Laboratories, США) с
пористостью 0,45 mM в блоттере Trans-Blot Cell (Bio-Rad Laboratories, США).
Эффективность переноса проверяли, окрашивая мембрану пунцовым S.
2.7. Оценка уровней белков mat-BDNF, pro-BDNF, Bcl-XL, Bax, прокаспазы-3,
активной каспазы-3 и GR методом полуколичественного иммуноблота
Оценку уровней целевых белков производили методом полуколичественного
иммуноблота мембран, содержащих разделенный одномерным денатурирующим гельэлектрофорезом суммарный белок (Menshanov et al., 2006).
59
Для детекции целевых белков использовали поликлональные кроличьи антитела
фирмы Santa Cruz Biotechnology (США) к Bcl-XL (M-125) (разведение 1:250), Bax (P19) (1:250), каспазе-3 (H-277) (1:250), mat-BDNF и pro-BDNF (N-20) (1:250), GR (H300) (1:250) и актину (I-19-R) (1:5000). Мембраны блокировали в течение 60 минут
(5% раствор обезжиренного молока в PBS — изотоническом фосфатном буфере, pH
7.4), инкубировали 2 часа в растворе первичного антитела, производили трехкратную
(по 5 минут) отмывку в 0,05% растворе TWEEN-20 в PBS, инкубировали в течение 1
часа в растворе вторичного антитела, конъюгированного с щелочной фосфатазой, и
производили трехкратную (по 5 минут) отмывку в 0,05% растворе TWEEN-20 в PBS.
Проявление целевого сигнала на мембране производили с использованием 5бром-4-хлор-3-индолил фосфата (BCIP) и нитротетразолия голубого (NBT). Уровень
Bcl-XL (29 KDa), Bax (21 KDa), mat-BDNF (12 KDa), pro-BDNF (35 KDa), GR (94KDa),
интактной (32 KDa) и активированной (17 KDa) каспазы-3 оценивали относительно
уровня актина после сканирования мембран путем компьютерной денситометрии
(Scion Image, ver. 4.0.2; Scion Corporation, 2000, США).
Метод иммуноблота традиционно используется для качественного выявления
белка. В данной работе этот метод использован для количественной оценки уровней
белков в структурах мозга 3- и 8-дневных крыс. Такое применение данного метода
возможно благодаря тому, что соблюдается линейная зависимость между уровнем
сигнала и количеством белка на дорожке полиакриламидного геля. Данная линейная
зависимость для белка сравнения – актина, содержание которого в гомогенате ткани
относительно всех анализируемых белков наиболее высокое, соблюдается в диапозоне
от 5 до 70 мкг белка на дорожку (Рис. 4А). Для активной каспазы-3, белка, содержание
которого в гомогенате самое низкое из исследуемых белков, данное соотношение
справедливо в более широком диапозоне – от 5 до 100 мкг белка на дорожку (Рис. 4Б).
Остальные анализируемые белки (Bcl-XL, Bax, mat-BDNF, pro-BDNF, GR и
прокаспаза-3) являются промежуточными по содержанию в гомогенате и для них
также соблюдается линейная зависимость между уровнем сигнала и количеством
белка. Для дальнейшего анализа использовали мембраны, полученные после
60
разделения аликвот, содержащих по 50 мкг суммарного белка. Вариабельность
детектируемого уровня сигнала в единичном образце не превышала 20%.
Соблюдение
линейного
соотношения
между
интесивностью
сигнала
и
количеством белка в образце позволило использовать метод иммуноблота для
количественной
оценки
уровней
исследуемых
белков
в
структурах
мозга
А
1200
уровень сигнала,
1000
800
600
400
200
0
10
20
30
40
50
60
70
80
количество белка, мкг на дорожке
сумма яркости пикселей денситометрии
уровень сигнала,
сумма яркости пикселей денситометрии
неонатальных крыс.
Б
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
количество белка, мкг на дорожке
Рис. 4. Линейная зависимость между уровнем сигнала и количеством определяемого белка –
актина (А) и активной каспазы-3 (Б).
2.8. Реактивы
Все реактивы, за исключением вышеуказанных, были приобретены у компании
«Sigma-Aldrich», США.
2.9. Статистическая обработка данных
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием
пакета программ STATISTICA (ver. 8.0; StatSoft, Inc., 2001): влияние воздействий
оценивали однофакторным дисперсионным анализом (ANOVA), достоверность
различий между группами устанавливали согласно LSD критерию Фишера.
Корреляции между уровнями белков определяли, вычисляя значения линейного
коэффициента корреляции Спирмена.
61
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Анализ взаимного сопряжения экспрессии белков апоптоза в гиппокампе и
стволе головного мозга 3-дневных крысят.
В настоящее время уже имеются достаточно подробные сведения об уровнях
отдельных белков программируемой гибели клеток в отделах формирующегося
головного мозга млекопитающих (Menshanov et al., 2006; Vekrellis et al., 1997).
Поскольку эти белки участвуют в общем для них процессе физиологического
апоптоза, естественным является предположение об их взаимосвязанной экспрессии.
Однако специальных исследований этого вопроса в литературе нам не встретилось.
Поэтому начальным этапом нашей работы стало выявление межрегиональных
особенностей взаимного сопряжения экспрессии белков апоптоза в формирующемся
головном мозге. В эксперименте использованы животные 3-го дня жизни, которые
уже миновали период послеродового стресса, и в мозге которых ещё проходят с
разной интенсивностью, специфичной для каждого отдела, процессы пролиферации и
элиминации избыточных клеток. В гиппокампе в этот период развития данные
процессы протекают активнее, чем в стволовой части мозга (Oppenheim, 1991).
Одна из закономерностей – различие гиппокампа и ствола по степени активации
основной исполнительной протеазы апоптозного каскада – каспазы-3 – важного
маркера протекания программируемой клеточной гибели в неонатальном мозге.
Уровень активной каспазы-3 в гиппокампе у 3-дневных животных в полтора раза
выше, чем в стволе мозга (Рис. 5Б; F
(1,19)=16.20,
p=0.00072). При этом уровень
антиапоптозного белка Bcl-XL, напротив, достоверно выше в стволе мозга в
сравнении с гиппокампом (Рис. 5А; F (1,19)=43.52, p=0.000001). Вместе с тем, различий
в уровнях экспрессии проапоптозного Bax (F
(1,19)=1.30,
(1,19)=0.45,
p=0.51) и прокаспазы-3 (F
p=0.32) между этими отделами мозга не выявлено.
62
Bcl-XL, усл.ед.
0,3
0,2
*
0,1
C
Г
К
активная каспаза-3, усл.ед.
Б
A
1,2
1,0
0,8
*
0,6
0,4
0,2
C
Г
К
Рис. 5. Уровни белков Bcl-XL (A) и активной каспазы-3 (Б) в стволе (С), гиппокампе (Г) и
коре головного мозга (К) 3-дневных крысят. * - p<0,05 по сравнению с уровнем в других
отделах мозга. Величина оси ординат выражена в условных единицах денситометрии.
Данные представлены как средние значения ± ошибка среднего.
Сами по себе сведения об уровнях белков апоптоза в ткани не позволяют судить
о наличии или отсутствии сопряжения их экспрессии. Для выявления возможности
такой взаимосвязи может быть полезной индивидуальная изменчивость животных по
экспрессии белков апоптоза. Кроме различий в физическом развитии крысят в наших
экспериментах наблюдались и заметные индивидуальные особенности по экспрессии
белков апоптозного каскада в их мозге. Коэффициенты вариации экспрессии
отдельных белков в исследованных отделах мозга находились в диапазоне 10–40% в
стволе и 10–28% в гиппокампе, что позволяет использовать эту индивидуальную
изменчивость для оценки характера возможного сопряжения экспрессии белков
апоптоза между собой.
Корреляционный анализ, проведенный между уровнями белков апоптоза в
образцах ткани ствола мозга, полученных от индивидуальных 3-дневных животных,
не выявил каких-либо существенных взаимосвязей между экспрессией про- и
антиапоптозных молекул.
В отличие от ствола мозга, в гиппокампе, в котором в эти сроки развития
процессы апоптоза клеток более интенсивны, обнаружены высокодостоверные
63
отрицательные корреляции между количеством белка Bcl-XL и уровнями белка Bax, а
также
активной
формы
каспазы-3.
При
этом
между
содержанием
обоих
проапоптозных белков, Bax и активной каспазы-3, в этом отделе мозга наблюдалась
отчетливая положительная взаимосвязь. Следует отметить, что связь между про- или
антиапоптозным регуляторными белками и каспазой-3 выявляется отчетливо лишь на
стадии ее активации. Ни Bax, ни Bcl-XL не обнаруживали значимых корреляций с
прокаспазой-3 (Таблица 1).
По всей видимости, имеются внешние по отношению к системе белков и в то же
время общие для них координаторы их экспрессии. Одними из таких координаторов
могут выступать белки семейства нейротрофинов, из которых наиболее важную роль
в ЦНС играет мозговой нейротрофический фактор (BDNF). Он усиливает экспрессию
Bcl-XL и других антиапоптозных белков Bcl-2 семейства, а также предотвращает
активацию каспазы-3 и индукцию апоптоза при инкубации клеток гиппокампа и
других областей мозга in vitro. В то же время, незрелая форма этого белка – proBDNF
– стимулирует экспрессию проапоптозных белков Bcl-2 семейства и способствует
активации каспазы-3 в экспериментах in vitro (Renton et al., 2010). Однако вопрос о
роли форм мозгового нейротрофического фактора в координации экспрессии белков
апоптоза в формирующемся головном мозге до сих пор остается мало изученным. В
этой связи, следующим этапом нашей работы стало определение уровней экспрессии
форм BDNF и соотнесение их содержания с уровнями ключевых белков апоптоза в
различных отделах мозга неонатальных крысят.
64
Таблица 1. Корреляции между уровнями белков апоптоза в стволе мозга и гиппокампе 3дневных животных (н.д. – статистически недостоверно (р > 0.05).
Ствол мозга
Bcl-XL
прокаспаза-3
Bax
Bax
r = –0.279 н.д.
прокаспаза-3
r = +0.390 н.д.
r = +0.393 н.д.
активная каспаза-3
r = +0.248 н.д.
r = –0.451 н.д.
r = +0.076 н.д.
Гиппокамп
Bcl-XL
прокаспаза-3
Bax
Bax
r = –0.651, p = 0.022
прокаспаза-3
r = –0.360 н.д.
r = +0.175 н.д.
активная каспаза-3
r = –0.740, p = 0.006
r = +0.653, p = 0.021
r = +0.399 н.д.
3.2. Экспрессия форм BDNF в отделах мозга неонатальных крысят.
Для оценки возможного вклада форм BDNF в межрегиональные различия по
ключевому признаку апоптоза – уровню белка активной каспазы-3, в следующих
экспериментах исследовали соотношение про- и зрелой формы нейротрофина с этой
исполнительной протеазой апоптоза в отделах мозга 3- и 8-дневных животных.
А) 3-дневные животные
У 3-дневных крысят существенных различий между стволом мозга, гиппокампом
и корой как по экспрессии pro-BDNF (F
(2,18)=1.30,
(2,18)=1.23,
p=0.31), так и mat-BDNF (F
p=0.33) не обнаружено. Очевидно, особенности экспрессии обеих форм
BDNF вряд ли способны внести в данном возрасте существенный вклад в
межрегиональные особенности формирования структур головного мозга.
Б) 8-дневные животные
Представляется интересным выяснить возможное наличие подобных влияний в
более зрелом возрасте. Для этого мы оценивали уровни экспрессии pro- и mat-BDNF, а
65
также их возможную взаимосвязь с содержанием активной каспазы-3 в отделах мозга
у животных более позднего, 8-дневного возраста.
В этих опытах были обнаружены региональные различия в уровнях зрелой
формы
мозгового
предшественника
нейротрофического
(pro-BDNF)
между
фактора
стволовой
(mat-BDNF)
частью
и
мозга,
его
белка-
мозжечком,
гиппокампом и корой. Уровень mat-BDNF наиболее низок в коре мозга, а наиболее
высок – в стволе мозга (практически в 2 раза выше, чем в гиппокампе, и более чем в 2
выше, чем в мозжечке) (Рис. 6; F(3, 22) = 11.94, p = 0.00008). Уровень pro-BDNF в коре
мозга был также достоверно (более чем в 2 раза) ниже уровня в стволе мозга и
гиппокампе (Рис. 7; F(3, 20) = 3.15, p = 0.048).
I.
Mat-BDNF
актин
Мозж.
Ствол Гипп.
Кора
II.
mat-BDNF, усл. ед.
2,0
*
1,6
1,2
0,8
0,4
*
мозжечок
ствол
гиппокамп
кора
Рис. 6. Уровни белка mat-BDNF в отделах мозга 8-дневных крысят. I. – фотографии мембран
имуноблота. II. – график с количественной оценкой. * - p<0,05 по сравнению с другими
отделами мозга. Величина оси ординат выражена в условных единицах денситометрии.
Данные представлены как средние значения ± ошибка среднего.
66
I.
Pro-BDNF
актин
Мозж.
Ствол
Гипп.
Кора
pro-BDNF, усл. ед.
II.
0,8
0,6
*
0,4
0,2
мозжечок
ствол
гиппокамп
кора
Рис. 7. Уровни белка pro-BDNF в отделах мозга 8-дневных крысят. I. – фотографии мембран
имуноблота. II. – график с количественной оценкой. * - p<0,05 по сравнению со значениями в
гиппокампе и стволе мозга. Величина оси ординат выражена в условных единицах
денситометрии. Данные представлены как средние значения ± ошибка среднего.
Уровни активной каспазы-3 в коре мозга и гиппокампе достоверно выше, чем в
стволовой части мозга и мозжечке (Рис. 8; F(3,
11)
= 33.89, p < 0.001). Отношение
уровней mat-BDNF к pro-BDNF в коре мозга в силу крайне низкого содержания
зрелого BDNF было значительно более низким, чем в остальных исследованных
структурах (Рис. 9; F(3, 21) = 3.68, p = 0.028). Между содержанием активной каспазы-3 и
каждой из форм BDNF в отделах мозга 8-дневных крысят связи не выявлено, однако
между распределением уровня активной каспазы-3 и отношением mat-BDNF/proBDNF наблюдается обратная зависимость (Рис. 9). Это может свидетельствовать в
пользу
влияния
развивающегося
отношения
мозга
к
mat-BDNF/pro-BDNF
вступлению
в
апоптоз
на
у
склонность
8-дневных
клеток
животных.
67
I.
Активная
каспаза-3
актин
Мозж.
активная каспаза-3, усл. ед.
II.
Ствол
Гипп.
Кора
0,05
0,04
0,03
*
0,02
0,01
*
мозжечок
ствол
гиппокамп
кора
Рис. 8. Уровни активной каспазы-3 в отделах мозга 8-дневных крысят. I. – фотографии
мембран имуноблота. II. – график с количественной оценкой. * - p<0,05 по сравнению с
гиппокампом и корой головного мозга. Величина оси ординат выражена в условных
единицах денситометрии. Данные представлены как средние значения ± ошибка среднего.
68
120
% 80
**
40
**
мозжечок
*
кора
ствол
гиппокамп
Рис. 9. Отношение mat-BDNF/pro-BDNF (светлые столбцы) и уровни активной каспазы-3
(темные столбцы) в отделах мозга 8-дневных крысят. * - p<0,05 по сравнению с другими
отделами мозга; ** - p<0,05 по сравнению с гиппокампом и корой головного мозга. Величина
оси ординат выражена в % относительно величины в отделе мозга с максимальным средним её
значением, принятым за 100%. Данные представлены как средние значения ± ошибка среднего.
Помимо BDNF и его белка-предшественника, вклад в координацию экспрессии
белков апоптоза в развивающемся головном мозге могут давать гормоны, в частности,
глюкокортикоиды, которые отвечают за адаптивный ответ организма на стресс, а их
влияние на развивающийся мозг в наибольшей степени проявляются в критические
периоды, в том числе имеющие место в раннем постнатальном онтогенезе. По этой
причине,
следующий
этап
работы
заключался
в
выяснении
влияния
глюкокортикоидов на экспрессию ключевых белков апоптозного каскада и форм
BDNF в отделах мозга неонатальных крысят.
3.3. Влияние глюкокортикоидов на уровни форм BDNF и ключевых белков
апоптозного каскада – Bcl-XL, Bax, прокаспазы-3 и активной каспазы-3 – в
отделах мозга неонатальных крысят.
Глюкокортикоиды реализуют своё действие на экспрессию генов через свои
рецепторы – транскрипционные факторы, активируемые гормоном (de Kloet et al.,
69
2005). Естественные глюкокортикоиды связываются с двумя типам рецепторов –
минералокортикоидными (MR) и глюкокортикоидными (GR), а их синтетические
аналоги, например, дексаметазон, являются селективными активаторами GR.
Наблюдаются региональные и возраст-зависимые особенности экспрессии GR в
отделах развивающегося мозга, а MR высоко экспрессируются лишь в нескольких
областях мозга, в числе которых гиппокамп и особенно его область зубчатой
извилины (de Kloet et al., 2005). При этом в гиппокампе их плотность резко возрастает
и практически достигает показателей взрослых особей лишь к концу первой недели
жизни (Edwards and Burnham, 2001). По вышеуказанным причинам, в следующем
эксперименте мы использовали животных двух ранее исследованных возрастов – 3-го
и 8-го дней жизни, а также препараты гормонов: гидрокортизона – естественного
неспецифического агониста MR и GR, и дексаметазона – синтетического селективного
активатора GR.
А) 3-дневные животные
Введение гидрокортизона или дексаметазона не приводило в этом возрасте к
достоверным изменениям уровней экспрессии pro-BDNF и mat-BDNF ни в одном из
исследованных отделов головного мозга, а также уровней белков апоптоза Bcl-XL,
Bax, прокаспазы-3, активной каспазы-3 в коре и стволе головного мозга.
Гидрокортизон и дексаметазон также не влияли на экспрессию белков Bcl-XL,
прокаспазы-3 и активной каспазы-3 в гиппокампе 3-дневных животных (Таблица 2).
Однако имелась тенденция к снижению в этом отделе мозга под действием
гидрокортизона уровня экспрессии проапоптозного белка Bax (Таблица 2; F(3,18)=2.43;
p=0.099).
70
Таблица 2. Уровни белков pro-BDNF, mat- BDNF, Bcl-XL, Bax, прокаспазы-3 и активной
каспазы-3 в отделах головного мозга 3-дневных животных после воздействия
глюкокортикоидами (выражены в % относительно интактных).
Ствол мозга
Название
белка
% содержания относительно группы контроля
интакт.
pro-BDNF
100.0±9.2
mat-BDNF
100.0±37.3
Bcl-XL
100.0±5.9
Bax
100.0 ±7.4
прокаспаза-3 100.0±13.2
акт. каспаза-3 100.0±20.5
физ. р-р
123.7±11.1
110.4±16.2
114.7±5.9
88.9 ±3.7
118.4±15.8
109.1±11.4
дексамет.
126.1±15.2
78.2±12.9
108.8±8.8
103.7±7.4
121.1±21.1
118.2±9.1
гидрокорт.
105.3±11.2
104.8±18.9
111.8 ±8.8
96.3±11.1
110.5±13.2
113.6±11.4
F критерий
F(3, 20) = 1.21, p = 0,33
F(3, 18) = 0.38, p = 0,77
F(3, 20) = 0.64, p = 0,60
F(3, 20) = 0.83, p = 0,49
F(3, 20) = 0.39, p = 0,76
F(3, 17) = 0.32, p = 0,81
Гиппокамп
Название
белка
% содержания относительно группы контроля
интакт.
pro-BDNF
100.0±14.1
mat-BDNF
100.0±22.6
Bcl-XL
100.0±8.7
Bax
100.0±13.3
прокаспаза-3 100.0 ±3.5
акт. каспаза-3 100.0 ±4.1
физ. р-р
95.5±7.8
133.5±25.7
100.0±8.7
76.7 ±10.0
100.0 ±6.9
104.3±10.4
дексамет.
99.4±12.1
111.6±22.1
100.0 ±4.4
80.0 ±6.7
110.3 ±6.9
91.7 ±9.1
гидрокорт.
91.2±8.5
116.2±17.9
95.7±8.7
63.3 ±6.7
100.0 ±3.5
94.8 ±6.7
F критерий
F(3, 20) = 0.14, p = 0,94
F(3, 17) = 0.74, p=0,54
F(3, 19) = 0.055, p = 0,98
F(3, 18) = 2.43, p= 0,099
F(3, 20) = 0.80, p = 0,51
F(3, 19) = 0.50, p = 0,69
Кора мозга
Название
белка
% содержания относительно группы контроля
интакт.
pro-BDNF
100.0±18.9
Bcl-XL
100.0±17.1
Bax
100.0±19.1
прокаспаза-3 100.0±14.6
акт. каспаза-3 100.0±14.3
физ. р-р
95.0±28.7
117.1±25.7
147.6±33.3
114.6±24.4
145.7±22.9
дексамет.
75.8±10.7
117.1±17.1
128.6 ±28.6
114.6 ±22.0
125.7±22.9
гидрокорт.
93.3±20.4
111.4 ±14.3
128.6 ±23.8
117.1 ±17.1
125.7±14.3
F критерий
F(3, 20) = 0.26, p = 0,85
F(3, 20) = 0.22, p = 0,88
F(3, 20) = 0.49, p = 0,69
F(3, 20) = 0.14, p = 0,93
F(3, 20) = 0.90, p = 0,46
71
Б) 8-дневные животные
Статистически значимых эффектов гидрокортизона и дексаметазона на уровни
pro-BDNF и mat-BDNF в стволе и коре головного мозга 8-дневных животных через 6
часов после инъекции не выявлено. В то же время, в гиппокампе гидрокортизон на
треть снижал уровень pro-BDNF (Рис. 10; таблица 3; F(3,21)= 8.31, p=0.0008).
I.
mat-BDNF
Pro-BDNF
актин
1
II.
содержание белков в гиппокампе, %
актин
2
3
4
1
2
3
4
120
100
*
80
60
40
20
0
proBDNF
1 2 3 4 matBDNF 1 2 3 4
Рис. 10. Уровни белков pro-BDNF и mat-BDNF в гиппокампе 8-дневных животных через 6
часов после введения дексаметазона в дозе 0,2 мг/кг, или гидрокортизона в дозе 5 мг/кг. I. –
фотографии мембран иммуноблота, II. – график с количественной оценкой. 1 – интактные, 2
–получившие инъекцию физиологического раствора, 3 – получившие инъекцию
дексаметазона, 4 – получившие инъекцию гидрокортизона. * - p<0,05 по сравнению с
контрольными группами. По оси У отложен % от уровня данного белка у группы интактных
животных. Данные представлены как средние значения ± ошибка среднего.
72
Таблица 3. Уровни белков pro-BDNF, mat- BDNF, Bcl-XL, Bax, прокаспазы-3 и активной
каспазы-3 в отделах головного мозга 8-дневных животных после воздействия
глюкокортикоидами (выражены в % относительно интактных).
Ствол мозга
Название
белка
% содержания относительно группы контроля
интакт.
pro-BDNF
100.0±19.5
mat-BDNF
100.0±21.0
Bcl-XL
100.0±24.5
Bax
100.0 ±9.8
прокаспаза-3 100.0±13.8
акт. каспаза-3 100.0±11.8
физ. р-р
82.4 ±21.7
81.6±17.0
99.8 ±19.2
117.0 ±6.6
102.4±10.3
91.7 ±10.4
дексамет.
90.5±9.5
74.0±19.9
62.1 ±11.9
104.9 ±8.8
136.3 ±12.1
84.7 ±11.1
гидрокорт.
63.9±14.5
74.3±14.6
99.4 ±17.3
121.7 ±10.1
147.4 ±15.5
97.8 ±14.0
F критерий
F(3, 17) = 0.84, p = 0,49
F(3, 18) = 0.29, p = 0,83
F(3, 21) = 1.14, p = 0,36
F(3, 21) = 1.28, p = 0,31
F(3, 20) = 3.27, p = 0,043
F(3, 19) = 0.31, p = 0,82
Гиппокамп
Название
белка
% содержания относительно группы контроля
интакт.
pro-BDNF
100.0 ±6.4
mat-BDNF
100.0 ±8.6
Bcl-XL
100 ±10.9
Bax
100.0±16.2
прокаспаза-3 100.0 ±8.8
акт. каспаза-3 100.0±10.5
физ. р-р
99.7 ±4.8
85.8 ±11.5
95.8 ±3.6
101.0 ±7.7
93.2 ±8.1
81.1 ±9.3
дексамет.
84.2 ±3.6
101.5 ±15.3
111.2 ±15.3
83.8 ±9.0
100.6 ±7.4
75.1 ±10.5
гидрокорт.
69.9 ±4.8
95.3 ±9.5
165.4 ±19.8
102.0 ±9.3
70.7 ±4.6
53.2 ±6.6
F критерий
F(3, 21) = 8.32, p = 0,00078
F(3, 22) = 0.35, p = 0,79
F(3, 18) = 5.93, p = 0,0054
F(3, 22) = 0.59, p = 0,63
F(3, 18) = 3.27, p = 0,045
F(3, 18) = 3.75, p = 0,030
Кора мозга
Название
белка
% содержания относительно группы контроля
интакт.
pro-BDNF
100.0±26.1
Bcl-XL
100.0 ±8.4
Bax
100.0±10.1
прокаспаза-3 100.0 ±8.5
акт. каспаза-3 100.0 ±6.1
физ. р-р
84.3 ±17.4
107.4 ±5.9
102.5 ±8.4
99.9 ±7.0
87.7 ±7.4
F критерий
дексамет. гидрокорт.
92.7 ±10.2
72.5 ±17.6 F(3, 21) = 0.47, p = 0,71
79.6 ±11.1
105.5 ±4.6 F(3, 22) = 2.43, p = 0,093
91.0 ±8.4
104.0 ±9.7 F(3, 22) = 0.41, p = 0,75
87.9 ±9.8
110.0 ±10.0 F(3, 22) = 1.01, p = 0,41
125.7 ±22.9
91.1 ±6.9
F(3, 21) = 0.48, p = 0,70
73
В стволе и коре головного мозга 8-дневных животных глюкортикоиды не
оказывали заметных эффектов на уровни белков апоптоза Bcl-XL, Bax и активной
каспазы-3. Однако в отличие от коры, в которой и прокаспаза-3 мало изменялась под
влиянием
гормонов,
в
стволе
гидрокортизон
достоверно
повышал
уровень
прокаспазы-3 по сравнению с контрольными группами (таблица 3; F(3,20) = 3.27,
p=0.04). Под влиянием дексаметазона также наблюдалась тенденция к повышению
уровня прокаспазы-3 в стволе мозга, что, очевидно, указывает на реализацию данного
эффекта через глюкокортикоидные, а не минералокортикоидные рецепторы.
В гиппокампе 8-дневных крысят избирательный агонист глюкокортикоидных
рецепторов дексаметазон не влиял на уровни экспрессии белков Bcl-XL, Bax,
прокаспазы-3 и активной каспазы-3. В то же время, хотя неселективный агонист
глюко- и минералокортикоидных рецепторов гидрокортизон и не изменял в заметной
мере уровни экспрессии проапоптозного белка Bax, он вызывал достоверное
полуторакратное повышение уровня антиапоптозного белка Bcl- XL (Рис. 11; таблица
3; F(3,18)=5.93, p=0.005).
Также в гиппокампе гидрокортизон достоверно снижал уровни интактной (Рис.
12; таблица 4; F(3,18)= 3.27, p=0.046) и активной (Рис. 12; таблица 4; F(3,18)= 3,75, p=0,03)
форм каспазы-3, причем в случае с активной каспазой-3 снижение уровня было
двукратным.
Таким образом, глюкокортикоиды, связывающиеся с MR, способны оказывать
антиапоптозные эффекты на экспрессию белков в гиппокампе 8-дневных животных, а
именно в эти сроки экспрессия MR в этом отделе мозга уже достаточно высока.
74
I.
Bcl-XL
Bax
актин
актин
1
2
3
4
1
2
3
4
содержание белков в гиппокампе, %
II.
*
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Bcl-XL
1 2 3 4
Bax 1 2 3 4
Рис. 11. Уровни белков Bcl-XL и Bax в гиппокампе 8-дневных животных через 6 часов после
введения дексаметазона в дозе 0,2 мг/кг, или гидрокортизона в дозе 5 мг/кг. I. – фотографии
мембран иммуноблота, II. – график с количественной оценкой. 1 – интактные, 2 –получившие
инъекцию физиологического раствора, 3 – получившие инъекцию дексаметазона, 4 –
получившие инъекцию гидрокортизона. * - p<0,05 по сравнению со всеми остальными
группами. По оси У отложен % от уровня данного белка у группы интактных животных.
Данные представлены как средние значения ± ошибка среднего.
75
I.
прокаспаза-3
активная
каспаза-3
актин
актин
1
2
3
4
1
2
3
4
содержание белков в гиппокампе, %
II.
120
100
80
*
*
60
40
20
0
1 2 3 4
прокаспаза-3
1 2 3 4
активная
каспаза-3
Рис. 12. Уровни прокаспазы-3 и активной каспазы-3 в гиппокампе 8-дневных животных через
6 часов после введения дексаметазона в дозе 0,2 мг/кг, или гидрокортизона в дозе 5 мг/кг. I. –
фотографии мембран иммуноблота, II. – график с количественной оценкой. 1 – интактные, 2
–получившие инъекцию физиологического раствора, 3 – получившие инъекцию
дексаметазона, 4 – получившие инъекцию гидрокортизона. * - p<0,05 по сравнению с
контрольными группами. По оси У отложен % от уровня данного белка у группы интактных
животных. Данные представлены как средние значения ± ошибка среднего.
76
В) Анализ эффектов дексаметазона на уровень активной каспазы-3 в мозге
через 6, 24 и 120 ч после введения гормона.
Помимо немедленных влияний в литературе широко описаны отсроченные
эффекты гормонов стресса (Takahashi et al., 2012; Zuloaga et al., 2012a). Поэтому в
следующем эксперименте исследовалась возможность наличия подобных влияний на
уровень основного эффектора апоптоза – активной каспазы-3 – в отделах мозга
неонатальных крысят.
Дексаметазон достоверно не изменил уровни про- и активной форм каспазы-3 в
гиппокампе, коре и стволе мозга, как через 6, так и через 24 часа после инъекции,
проводимой крысятам на 3-й день жизни. Однако анализ экспрессии каспазы-3 через
120 часов после введения глюкокортикоидов выявил полуторакратное увеличение
уровня активной формы этого фермента в коре мозга (Рис. 13; F(1,11) = 13.27; p= 0.004),
несмотря на неизменный уровень проформы каспазы-3 (Рис. 13; F(1,11)= 0.81; p = 0.39).
Таким образом, хотя мы не обнаружили острых эффектов дексаметазона на
экспрессию изучаемых нами белков, мы выявили его отложенный проапоптозный
эффект: значительное увеличение уровня активной каспазы-3 в коре мозга через 120
часов после введения гормона. Отложенный характер действия дексаметазона и
отсутствие изменений уровня прокаспазы-3 могут говорить о наличии непрямых,
вовлекающих в свои эффекты дополнительные белки и процессы-посредники,
механизмов воздействия глюкокортикоидов на процессы активации каспазы-3 и,
соответственно, индукции программируемой гибели клеток развивающегося мозга.
активная каспаза-3, усл. ед.
77
*
1,00
0,75
0,50
0,25
6ч
24 ч
120 ч
Рис. 13. Уровни прокаспазы-3 (светлые столбцы) и активной каспазы-3 (тёмные столбцы) в
коре головного мозга 3-дневных животных через 6, 24 и 120 часов после введения
дексаметазона. * - p<0,05 по сравнению с животными контрольной группы (не показано).
Величина на оси ординат выражена в условных единицах денситометрии. Данные
представлены как средние значения ± ошибка среднего.
3.4. Эффекты гипоксии и дексаметазона на экспрессию GR в неонатальном
мозге.
Сложные пути регуляции процессов апоптоза в формирующемся головном мозге
являются результатом взаимодействия глюкокортикоидной сигнализации с другими
важнейшими явлениями в ходе рождения и раннего развития организма, в
особенности, с гипоксией тканей мозга. Существование взаимодействия этих двух
механизмов in vitro и в мозге взрослых животных, проявляющееся в изменении
эффектов одного из этих воздействий, применимого на фоне другого, освещено в
мировой литературе (Kodama et al., 2003; Xu et al., 2011). Однако до сих пор не
проясненными оставались особенности этого взаимодействия в головном мозге в
раннем онтогенезе.
Мы обнаружили связь влияний гипоксии и глюкокортикоидов на примере
регион-специфического изменения ими экспрессии глюкокортикоидных рецепторов в
структурах мозга 3-дневных крысят. В коре мозга под влиянием дексаметазона
экспрессия GR снижалась, причем предшествующий перед введением гормона эпизод
гипоксии не влиял на это снижение (Рис. 14A; таблица 5; F(3, 25) = 4.16, p = 0.016), но
при действии гипоксии после введения гормона данное снижение уже не
наблюдалось, однако дексаметазон и через 10 часов продолжал оказывать снижающий
78
эффект (Рис. 14Б; таблица 4; F(3, 24) = 2.98, p = 0.049). В гиппокампе (F(8, 41) = 1.14, p =
0.36) и стволе мозга (F(8, 43) = 0.52, p = 0.84) экспрессия глюкокортикоидных
рецепторов под влиянием гипоксии и дексаметазона не изменялась.
I.
GR
актин
К
II.
Г
140
Д
Г+Д
А
К
Г
Д
Д+Г
Б
GR в коре мозга, %
120
100
*
**
80
60
*
40
20
К Г Д (Г+Д)
К Д Г (Д+Г)
Рис. 14. Уровень белка GR в коре головного мозга 3-дневных животных после гипоксии
и/или введения дексаметазона в дозе 0,2 мг/кг. I. – фотографии мембран иммуноблота, II. –
график с количественной оценкой. А – пост-гипоксическое введение дексаметазона; Б –
предгипоксическое введение дексаметазона. K - интактные животные, а также животные,
которым вводили физ. раствор. Г - животные, подвергнутые гипоксии. Д - животные,
которым вводили дексаметазон. Г+Д - животные, сначала подвергнутые гипоксии, и после
этого инъецированные дексаметазоном. Д+Г - животные, сначала инъецированные
дексаметазоном, и после этого подвергнутые гипоксии. * - p<0,05 по сравнению с группами К
и Г (в А); ** - p<0,05 по сравнению со всеми остальными группами в Б. По оси У отложен %
от уровня данного белка у группы контроля. Данные представлены как средние значения ±
ошибка среднего.
GR является регулятором экспрессии антиапоптозного белка Bcl-XL (Petrella et
al., 2006), а также потенциальным регулятором некоторых других белков каскада
апоптоза (Xu et al., 2011). Нашим следующим шагом стало исследование влияния
гипоксии и дексаметазона на экспрессию ключевых белков каскада апоптоза в отделах
мозга неонатальных животных.
79
Таблица 4. Влияние гипоксии и предгипоксического введения дексаметазона в дозе 0,2 мг/кг
за 4 часа до эпизода гипоксии на уровни белков GR, Bcl-XL, Bax и прокаспазы-3, а также на
отношение Bcl-XL/Bax в отделах головного мозга 3-дневных животных (значения выражены
в % относительно контроля).
Ствол мозга
Название
белка
GR
Bcl-XL
Bax
Bcl-XL/Bax
прокаспаза-3
% содержания относительно группы контроля
контроль
100.0±12.2
100.0±9.5
100.0±6.8
100.0±17.3
100.0±10.4
декс. 10 ч
91.3±9.3
81.3±19.3
96.3±9.5
84.4±26.2
105.1±8.0
гип. 6 ч
105.4±12.5
126.3±26.5
105.8±11.0
119.4±35.8
108.3±7.3
декс.+гип.
104.1±11.1
105.7±19.3
102.1±8.7
103.5±27.1
95.1±7.8
F критерий
F(3,22) = 0.71, p = 0.59
F(3,20) = 1.79, p = 0.15
F(3,21) = 0.51, p = 0.73
F(3,20) = 1.08, p = 0.39
F(3,21) = 1.40, p = 0.27
Гиппокамп
Название
белка
GR
Bcl-XL
Bax
Bcl-XL/Bax
прокаспаза-3
% содержания относительно группы контроля
контроль
100.0±11.3
100.0±13.8
100.0±7.8
100.0±24.1
100.0±9.3
декс. 10 ч
88.1±10.1
104.3±21.3
88.5±12.1
117.8±29.9
93.2±9.6
гип. 6 ч
108.5±10.7
112.5±24.2
105.3±13.7
106.8±32.1
104.1±7.3
декс.+гип.
105.3±9.1
110.3±18.2
107.2±11.1
102.9±25.3
109.1±9.2
F критерий
F(3,24) = 1.14, p = 0.36
F(3,23) = 0.76, p = 0.56
F(3,24) = 0.82, p = 0.52
F(3,20) = 1.13, p = 0.37
F(3,24) = 0.82, p = 0.52
Кора мозга
Название
белка
GR
Bcl-XL
Bax
Bcl-XL/Bax
прокаспаза-3
% содержания относительно группы контроля
контроль
100.0±13.4
100.0±12.5
100.0±8.6
100.0±19.7
100.0±7.1
декс. 10 ч
63.2±10.5
103.2±18.8
92.3±10.1
111.8±27.9
95.6±8.8
гип. 6 ч
88.9±9.4
107.5±21.2
102.5±12.0
104.9±29.0
101.3±10.2
декс.+гип.
105.8±14.2
110.1±20.2
90.2±7.8
122.1±25.9
98.5±9.2
F критерий
F(3,24) = 2.98, p = 0.049
F(3,22) = 0.34, p = 0.85
F(3,22) = 0.16, p = 0.96
F(3,22) = 0.29, p = 0.88
F(3,22) = 0.34, p = 0.85
80
Таблица 5. Влияние гипоксии и пост-гипоксического введения дексаметазона в дозе 0,2 мг/кг
через 4 часа после гипоксии на уровни белков GR, Bcl-XL, Bax, прокаспазы-3 и активной
каспазы-3, а также на отношение Bcl-XL/Bax в отделах головного мозга 3-дневных животных
(значения выражены в % относительно контроля).
Ствол мозга
Название
белка
% содержания относительно группы контроля
контроль
GR
100.0±12.2
Bcl-XL
100.0±9.5
Bax
100.0±6.8
Bcl-XL/Bax
100.0±17.3
прокаспаза-3 100.0±10.4
акт. каспаза-3 100.0±12.6
гип. 10 ч
108.8±14.5
112.5±10.4
75.2±16.0
149.6±38.4
92.3±12.5
94.1±14.5
декс. 6 ч
95.3±11.6
100.1±10.3
97.5±11.2
108.2±24.8
105.3±14.2
91.3±18.8
гип.10+д.
102.1±13.4
63.6±14.2
100.9±22.3
63.0±29.2
107.1±13.3
114.5±12.3
F критерий
F(3,24) = 0.19, p = 0.94
F(3,23) = 3.00, p = 0.049
F(3,23) = 2.94, p = 0.07
F(3,22) = 3.14, p = 0.059
F(3,24) = 0.17, p = 0.95
F(3,24) = 0.82, p = 0.52
Гиппокамп
Название
белка
% содержания относительно группы контроля
контроль
GR
100.0±11.3
Bcl-XL
100.0±13.8
Bax
100.0±7.8
Bcl-XL/Bax
100.0±24.1
прокаспаза-3 100.0±9.3
акт. каспаза-3 100.0±12.6
гип. 10 ч
113.1±11.7
90.2±12.9
87.1±12.5
103.6±17.9
103.2±8.5
105.6±14.9
декс. 6 ч
92.3±10.2
92.1±21.3
101.4±13.1
90.8±18.1
102.1±7.3
111.5±9.3
гип.10+д.
94.5±9.5
78.8±8.7
97.5±7.2
80.8±14.3
99.2±6.6
102.5±11.8
F критерий
F(3,22) = 1.42, p = 0.26
F(3,25) = 4.19, p = 0.063
F(3,26) = 0.82, p = 0.52
F(3,25) = 0.29, p = 0.88
F(3,26) = 0.15, p = 0.96
F(3,26) = 0.45, p = 0.77
Кора мозга
Название
белка
% содержания относительно группы контроля
контроль
GR
100.0±13.4
Bcl-XL
100.0±12.5
Bax
100.0±8.6
Bcl-XL/Bax
100.0±19.7
прокаспаза-3 100.0±7.1
акт. каспаза-3 100.0±12.3
гип. 10 ч
120.3±12.2
103.2±19.8
104.1±9.1
99.1±14.7
105.7±8.2
104.2±11.3
декс. 6 ч
57.2±5.1
107.1±20.2
112.3±8.7
95.4±22.9
103.1±9.4
109.1±10.1
гип.10+д.
73.8±10.8
96.1±18.1
99.2±11.2
96.9±14.7
107.8±10.2
110.3±12.3
F критерий
F(3,25) = 4.16, p = 0.016
F(3,25) = 0.20, p = 0.94
F(3,25) = 0.28, p = 0.89
F(3,25) = 0.62, p = 0.65
F(3,25) = 0.26, p = 0.9
F(3,25) = 0.86, p = 0.5
81
Таблица 6. Влияние гипоксии и отсроченного пост-гипоксического введения дексаметазона в
дозе 0,2 мг/кг через 16 часов после гипоксии на уровни белков Bcl-XL, Bax, прокаспазы-3 и
активной каспазы-3, а также на отношение Bcl-XL/Bax в отделах головного мозга 3-дневных
животных (значения выражены в % относительно контроля).
Ствол мозга
Название
белка
% содержания относительно группы контроля
контроль
Bcl-XL
100.0±9.5
Bax
100.0±6.8
Bcl-XL/Bax
100.0±17.3
прокаспаза-3 100.0±10.4
акт. каспаза-3 100.0±12.6
гип. 22 ч
88.7±14.1
79.8±17.7
111.1±27.5
108.7±7.9
68.8±7.3
декс. 6 ч
100.1±10.3
97.5±11.2
108.2±24.8
105.3±14.2
91.3±18.8
гип.22+д.
94.3±12.7
76.9±8.7
122.6±19.4
112.1±9.4
85.5±14.1
F критерий
F(3,27) = 1.01, p = 0.37
F(3,27) = 4.56, p = 0.044
F(3,27) = 1.06, p = 0.39
F(3,27) = 0.33, p = 0.85
F(3,26) = 5.34, p = 0.037
Гиппокамп
Название
белка
% содержания относительно группы контроля
контроль
Bcl-XL
100.0±13.8
Bax
100.0±7.8
Bcl-XL/Bax
100.0±24.1
прокаспаза-3 100.0±9.3
акт. каспаза-3 100.0±12.6
гип. 22 ч
109.2±14.3
105.2±5.8
103.8±19.3
103.6±9.7
119.5±11.4
декс. 6 ч
92.1±21.3
101.4±13.1
90.8±18.1
102.1±7.3
111.5±9.3
гип.22+д.
117.3±18.7
104.7±9.3
112.0±25.1
111.7±8.3
99.2±12.1
F критерий
F(3,27) = 0.94, p = 0.46
F(3,27) = 0.35, p = 0.84
F(3,27) = 0.19, p = 0.94
F(3,27) = 0.18, p = 0.95
F(3,27) = 0.82, p = 0.53
Кора мозга
Название
белка
% содержания относительно группы контроля
контроль
Bcl-XL
100.0±12.5
Bax
100.0±8.6
Bcl-XL/Bax
100.0±19.7
прокаспаза-3 100.0±7.1
акт. каспаза-3 100.0±12.3
гип. 22 ч
109.3±19.3
103.8±11.2
105.3±26.9
96.3±8.5
99.4±8.8
декс. 6 ч
107.1±20.2
112.3±8.7
95.4±22.9
103.1±9.4
109.1±10.1
гип.22+д.
98.5±16.9
105.7±9.3
93.2±21.8
107.3±6.5
115.2±9.2
F критерий
F(3,26) = 0.09, p = 0.99
F(3,25) = 0.2, p = 0.94
F(3,25) = 0.33, p = 0.86
F(3,26) = 0.67, p = 0.62
F(3,26) = 1.12, p = 0.37
82
3.5. Влияние гипоксии и дексаметазона на экспрессию ключевых белков
апоптозного каскада в отделах мозга неонатальных крысят.
А) Эффекты гипоксии
Через 12 часов после перенесенной гипоксии наблюдалась тенденция к
снижению прироста массы тела (F(1,82) = 3.51, p = 0.06), а через 16 часов после
гипоксии этот показатель был снижен достоверно (F(1,58) = 4.84, p = 0.03).
Несмотря на заметное влияние на интегральный показатель развития животного,
ни через 6, ни через 10, ни через 22 часа гипоксия сама по себе не изменяла в коре
мозга и гиппокампе экспрессию исследуемых нами белков апоптоза (Таблица 4, 5, 6).
Однако в стволе мозга гипоксия стимулировала экспрессию мРНК Bcl-XL и
мРНК Bcl-xL в стволе мозга, %
через 6, и через 10 часов (Рис. 15; F(2,26)= 16.95, p=0.00002).
**
160
*
120
80
40
К
Г6
Г 10
Рис. 15. Уровень мРНК Bcl-XL в стволе мозга 3-дневных животных через 6 и 10 часов после
гипоксии. К – контрольная группа; Г 6 – животные, подвергнутые гипоксии за 6 ч до забоя;
Г 10 – животные, подвергнутые гипоксии за 10 ч до забоя. * - p<0,005 по сравнению с
величиной у контрольной группы; ** - p<0,001 по сравнению с величиной у контрольной
группы. По оси У - % от уровня данного белка у контрольной группы. Данные представлены
как средние значения ± ошибка среднего.
83
Помимо влияния на транскрипцию апоптоз-ассоцированных генов, в стволе
мозга гипоксия изменяла и уровни белков. Уровень проапоптозного Bax имел
тенденцию к снижению через 10 часов после эпизода гипоксии относительно уровня у
интактных крысят (Рис. 16; F(1,22) = 3.14, p=0.09). Через 22 часа после гипоксии её
эффекта на экспрессию Bax уже не наблюдалось (Рис. 16; F(1,23) = 2.32, p=0.14).
Отсроченная (за 22 часа до забоя) гипоксия сама по себе в значительной мере снижала
уровень активной каспазы-3 в стволе мозга (Рис. 17; таблица 6; F(3,26) = 5.34, p = 0.037).
Как видно из представленных результатов (Таблицы 5, 6), в стволе мозга
неонатальных крысят гипоксия обладала антиапоптозными эффектами.
I.
Bax
актин
К
Г 10
Г 22
белок Bax в стволе мозга, %
II.
100
#
80
10
К
Г 10
Г 22
Рис. 16. Уровень белка Bax в стволе мозга 3-дневных животных через 10 и 22 часа после
гипоксии. I. – фотографии мембран иммуноблота, II. – график с количественной оценкой. К –
контрольная группа; Г 10 – животные, подвергнутые гипоксии за 10 ч до забоя; Г 22 –
животные, подвергнутые гипоксии за 22 ч до забоя. # - p<0,1 по сравнению с величиной у
контрольной группы. По оси У - % от уровня данного белка у контрольной группы. Данные
представлены как средние значения ± ошибка среднего.
84
Активная
каспаза-3
I.
актин
К
активная каспаза-3 в стволе мозга, %
II.
Г 22
100
80
*
10
К
Г 22
Рис. 17. Уровень активной каспазы-3 в стволе мозга 3-дневных животных через 22 часа после
гипоксии. I. – фотографии мембран иммуноблота, II. – график с количественной оценкой. К –
контрольная группа; Г 22 – животные, подвергнутые гипоксии за 22 ч до забоя. * - p<0,05 по
сравнению с величиной у контрольной группы. По оси У - % от уровня данного белка у
контрольной группы. Данные представлены как средние значения ± ошибка среднего.
Б) Эффекты действия дексаметазона и гипоксии
Было оценено влияние дексаметазона на интегральный показатель роста и
развития
животных
–
прирост
массы
тела.
Катаболические
эффекты
глюкокортикоидов в большинстве тканей организма хорошо известны (He et al., 2004).
В нашем эксперимете дексаметазон также c высокой достверностью снижал прирост
массы тела 3-дневных крысят относительно контролей уже через 6 часов (F(2,33) =
27.87, p< 0.000001). Прирост массы тела достоверно уменьшался через 6 часов после
85
введения дексаметазона, проведенного через 4 (Таблица 7; F(2,43) = 3.24, p = 0.048) или
12 часов после эпизода гипоксии (Таблица 7; F(2, 45)= 19.45, p = 0.00001).
Таблица 7. Прирост веса тела 3-дневных крысят за 6 часов после введения дексаметазона в
дозе 0,2 мг/кг, произведенного через 4 и 16 часов после гипоксии. Значения выражены в
граммах, данные представлены как среднее значение ± ошибка среднего.
Интервал
гипокс.-декс. 4 ч
Интервал
гипокс.-декс. 16 ч
контроль
гипоксия
гипоксия+декс.
0,36 ± 0,04
0,39 ± 0,19
0,09 ± 0,06
0,36 ± 0,04
0,38 ± 0,05
0,03 ± 0,04
F критерий
F(2,43) = 3.24,
p = 0.048
F(2,33) = 17.3,
p = 0.00001
Ни в одном из изученных отделов мозга 3-дневных животных сам по себе
дексаметазон ни через 6, ни через 10 часов после введения не вызывал достоверных
изменений уровней белков Bcl-XL, Bax и прокаспазы-3. Также под влиянием
дексаметазона не изменялся уровень активной каспазы-3 через 6 часов после его
введения (Таблица 2).
Однако, несмотря на отсутствие изменений в уровнях белков, в стволе мозга
наблюдалась достоверная стимуляция экспрессии мРНК антиапоптозного белка
Bcl-XL относительно контроля под действием дексаметазона вне зависимости от
наличия предшествующего (Рис. 18А; F(3,23) = 7.60, p= 0.001) или последующего (Рис.
18Б; F(3,22)= 5.74, p= 0.005) эпизода гипоксии.
86
мРНК Bcl-xL в стволе мозга, %
А
Б
**
**
160
*
**
**
*
120
80
40
К
Г Д (Г+Д)
К Д
Г (Д+Г)
Рис. 18. Уровень мРНК Bcl-XL в стволе мозга 3-дневных животных после гипоксии и/или
введения дексаметазона в дозе 0,2 мг/кг. А – пост-гипоксическое введение дексаметазона; Б –
предгипоксическое введение дексаметазона. K - интактные животные, а также животные,
которым вводили физ. раствор (контроль). Г - животные, подвергнутые гипоксии. Д животные, которым вводили дексаметазон. Г+Д - животные, сначала подвергнутые гипоксии,
и после этого инъецированные дексаметазоном. Д+Г - животные, сначала инъецированные
дексаметазоном, и после этого подвергнутые гипоксии. * - p<0,005 по сравнению с
контрольной группой; ** - p<0,001 по сравнению с контрольной группой. По оси У - % от
уровня мРНК у группы контроля. Данные представлены как средние значения ± ошибка
среднего.
87
I.
Bcl-XL
актин
К
II.
Г
Д
Г+Д
К
Г
Д+Г
Б
А
белок Bcl-xL в стволе мозга, %
Д
120
*
80
40
К
Г Д (Г+Д)
К
Д
Г (Д+Г)
Рис. 19. Уровень белка Bcl-XL в стволе мозга 3-дневных животных после гипоксии и/или
введения дексаметазона в дозе 0,2 мг/кг. I. – фотографии мембран иммуноблота, II. – график с
количественной оценкой. А – пост-гипоксическое введение дексаметазона; Б –
предгипоксическое введение дексаметазона. K - контроль. Г - животные, подвергнутые
гипоксии. Д - животные, которым вводили дексаметазон. Г+Д - животные, сначала
подвергнутые гипоксии, и после этого инъецированные дексаметазоном. Д+Г - животные,
сначала инъецированные дексаметазоном, и после этого подвергнутые гипоксии. * - p<0,05
по сравнению с остальными группами в А. По оси У - % от уровня данного белка у группы
контроля. Данные представлены как средние значения ± ошибка среднего.
88
Bcl-XL/Bax в стволе мозга, %
Совместное действие гипоксии и дексаметазона, вне зависимости от
последовательности приложения факторов, не приводило к достоверным изменениям
экспрессии белков Bcl-XL, Bax и прокаспазы-3 в коре мозга и гиппокампе (Таблицы 4,
5, 6). В гиппокампе имелась тенденция к снижению относительно интактного
контроля уровня антиапоптозного Bcl-XL при постгипоксическом действии
дексаметазона (Таблица 5; F(3,25) = 4.19, p = 0.063).
В стволе мозга рост экспрессии мРНК Bcl-XL при постгипоксическом введении
дексаметазона (Рис. 18А; F(3,23) = 7.60, p= 0.001) сопровождался снижением
содержания белка, что, по всей видимости, объясняется значительным вкладом
посттранскрипционных процессов в регуляцию его уровня в клетке (Niture et al.,
2011). Так, содержание Bcl-XL снижается практически в 2 раза под влиянием
дексаметазона, инъецированного через 4 часа после эпизода гипоксии (Рис. 19;
таблица 5; F(3,23)=3.00, p=0.049).
При постгипоксическом введения глюкокортикоидов наблюдалась тенденция к
снижению отношения Bcl-XL/Bax у животных, инъецированных гормоном после
гипоксии, относительно животных, подвергнутых гипоксии без последующего
введения дексаметазона (Рис. 20; таблица 5; F(3,22) = 3.14, p = 0.059). Таким образом, мы
обнаружили проапоптозное влияние постгипоксического применения дексаметазона
на экспрессию белков в стволе мозга, и тенденцию к этому в гиппокампе
неонатальных животных.
180
160
140
120
#
100
80
60
40
К
Г
Д
Г+Д
Рис. 20. Отношение Bcl-XL/Bax в стволе мозга 3-дневных животных после гипоксии и/или
введения дексаметазона в дозе 0,2 мг/кг. К – интактные животные, а также животные,
которым вводили физ. раствор за 6 ч до забоя (контроль); Г - животные, подвергнутые
эпизоду гипоксии за 10 ч до забоя; Д – животные, которым вводили дексаметазон за 6 ч до
забоя; Г+Д - животные, подвергнутые эпизоду гипоксии за 10 ч и инъецированные
дексаметазоном за 6 ч до забоя. # - p<0,1 по сравнению с группой «Г» (гипоксия). По оси У % от уровня белка у группы контроля. Данные представлены как средние значения ± ошибка
среднего.
89
Данный проапоптозный эффект проявлялся лишь при небольшой величине
временного интервала между воздействием гипоксии и введением гормона. При
больших
временных
интервалах,
проапоптозные
изменения
сменялись
антиапоптозными. Так, дексаметазон, вводимый через 12 часов после гипоксии,
приводил к снижению уровня Bax в стволе мозга (Рис. 21; таблица 6; F(3,27) = 4.56, p =
0.044), хотя указанные факторы по отдельности не обладали таким влиянием.
Вероятно
при
снижающий
увеличении
эффект
времени
гипоксии
на
между воздействиями
уровень
Bax
был
продолжительный
усилен
стимуляцией
дексаметазоном процессов распада этого белка (Dallaporta et al., 2000).
I.
Bax
актин
II.
белок Bax в стволе мозга, %
К
Г
Г+Д
100
*
80
10
К
Г
Г+Д
Рис. 21. Уровень белка Bax в стволе мозга 3-дневных животных после гипоксии и введения
дексаметазона в дозе 0,2 мг/кг. I. – фотографии мембран иммуноблота, II. – график с
количественной оценкой. К – контрольная группа; Г – животные, подвергнутые эпизоду
гипоксии за 22 ч до забоя; Г+Д – животные, подвергнутые эпизоду гипоксии за 22 ч до забоя
и инъецированные дексаметазоном за 6 ч до забоя. * - p<0,05 по сравнению с величиной у
контрольной группы. По оси У - % от уровня данного белка у контрольной группы. Данные
представлены как средние значения ± ошибка среднего.
90
Таким образом, по результатам работы можно сделать вывод, что белки апоптоза
имеют высокую степень взаимосвязанности экспрессии в гиппокампе, но не в
стволовой части мозга неонатальных животных, и их экспрессия в его отделах не
зависит от регулирующих влияний BDNF на третий день жизни. Глюкокортикоиды и
гипоксия способны существенно изменять экспрессию белков, отвечающих за
жизнеспособность клеток, в отделах развивающегося мозга. Гипоксия способна
оказывать антиапоптозное влияние на содержание белков апоптозного каскада в
стволе мозга 3-дневных животных, в котором не наблюдается заметных корреляций
между уровнями этих белков. Естественный глюкокортикоид гидрокортизон, в
отличие от синтетического дексаметазона активирующий и GR, и MR, вызывает
антиапоптозные изменения уровней белков апоптоза в гиппокампе неонатальных
животных, в котором, в отличие от ствола мозга, высока сопряженность их экспрессии
(Рис. 22); дексаметазон же сам по себе не оказывает острых эффектов на экспрессию
белков апоптоза, хотя вызывает отложенное на пять суток увеличение уровня
активной каспазы-3 в коре головного мозга.
Рис. 8. Механизмы влияния гидрокортизона на уровни активной каспазы-3 и её регуляторов в
гиппокампе 8-дневных животных.
Обнаружено взаимодействия эффектов дексаметазона и гипоксии на содержание
некоторых белков в отделах развивающегося головного мозга. В частности,
дексаметазон как сам по себе, так и после гипоксии значительно снижал уровень GR в
коре головного мозга 3-дневных животных, однако, если после введения гормона
следовал эпизод гипоксии, то уровень этого белка не снижался (Рис. 23А). Уровень
антиапоптозного белка Bcl-XL, на фоне стимуляции экспрессии его мРНК, снижался в
стволе развивающегося мозга при действии дексаметазона после гипоксии, но не
изменялся при предгипоксическом введении этого гормона и действии факторов по
отдельности (Рис. 23Б). Наблюдаемое несоответствие изменений уровней важнейшего
91
регуляторного антиапоптозного белка Bcl-XL и его мРНК в стволе мозга при
постгипоксическом введении дексаметазона, вероятнее всего, связано с влиянием
гипоксии и глюкокортикоидов не только на транскрипцию гена этого белка, но и на
посттранскрипционные процессы.
Рис. 9. Механизмы влияния дексаметазона (сплошная линия) и гипоксии (прерывистая
линия) на уровни белков GR в коре мозга (А) и Bcl-XL в стволе головного мозга (Б) 3дневных животных.
А: Дексаметазон, как сам по себе, так и после гипоксии, снижает уровень GR. При действии
гипоксии после введения этого гормона снижения уровня GR не происходит.
Б: Дексаметазона, действуя после эпизода гипоксии, снижает уровень белка Bcl-XL, однако
сами по себе ни гипоксия, ни гормон не оказывают эффектов на уровень Bcl-XL. При
предгипоксическом введении дексаметазона уровень Bcl-XL также не меняется.
Важно также отметить высокую степень воспроизводимости полученных
результатов: для проверки первичного результата каждый анализ уровней белков и
мРНК был повторен двукратно, а при оценке влияния гипоксии и дексаметазона на
содержание Bcl-XL – трёхкратно.
92
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Программируемая
гибель
клеток
является
непременным
участником
формирования центральной нервной системы в ходе развития (Oppenheim, 1991).
Предрасположенность клеток к гибели определяется соотношением экспрессии в них
про- и антиапоптозных белков, которые могут нейтрализовать действие друг друга
путем
белок-белкового
взаимодействия
(Roth
and
D'Sa,
2001).
Способ
функционирования этих белков позволяет предполагать взаимосвязь их экспрессии, а
также наличие особенностей подобной взаимосвязи в отделах формирующегося мозга,
различающихся
по
интенсивности
перинатальный
период
онтогенеза
в
них
физиологического
млекопитающих
апоптоза.
интенсивность
В
апоптоза
существенно ниже в каудальных (стволовых) отделах мозга крыс по сравнению с его
ростральными отделами, такими, как, например, кора или гиппокамп. При этом
показано, что и проапоптозный белок Bax, и антиапоптозный Bcl-XL, являющиеся
ключевыми регуляторами апоптоза в развивающеся нервной системе, широко и
достаточно равномерно экспрессируются в большинстве отделов мозга уже в раннем
постнатальном онтогенезе (Alonso et al., 1997; Vekrellis et al., 1997). Однако несмотря
на относительно высокий уровень апоптоза в мозге в неонатальный период в
сравнении со взрослым состоянием, анализ взаимосвязи экспрессии белков его
молекулярного каскада между собой затруднен ввиду невысокой частоты этого
процесса. Лишь небольшое количество клеток одновременно находится в процессе
программируемой гибели в отделах развивающегося головного мозга (White and
Barone, 2001). По-видимому, в связи с этим сведения по данному вопросу в
литературе до проведения нашего исследования отсутствовали. Наблюдаемый в
наших опытах более высокий в гиппокампе по сравнению со стволом мозга уровень
активной каспазы-3 хорошо согласуется с тем, что к 3-ему дню жизни ствол мозга
характеризуется невысокой интенсивностью физиологической гибели клеток, а в
гиппокампе, наоборот, процессы элиминации избыточных клеток проходят более
активно (Roth and D'Sa, 2001). Об этом же свидетельствует обнаруженный нами
93
сниженный в гиппокампе по сравнению со стволом уровень антиапоптозного белка
Bcl-XL при сопоставимой в обоих этих отделах экспрессии проапоптозного белка Bax.
Важно отметить, что сами по себе сведения об уровнях белков апоптоза в ткани
не позволяют судить о наличии или отсутствии сопряжения их экспрессии. После
проведения корреляционного анализа между уровнями белков апоптоза в образцах
ткани гиппокампа, полученных от индивидуальных животных, нами было впервые
выявлена высокая сопряженность экспрессии ключевых белков апоптозного каскада –
Bcl-XL, Bax и активной каспазы-3. Активность классического пути программируемой
гибели клеток, в реализацию которого вовлечены Bcl-XL, Bax и каспаза-3, в
неонатальный период развития в стволе головного мозга, в отличие от гиппокампа,
невелика (Oppenheim, 1991), что и могло стать одной из причин, препятствующих
проявлению взаимного сопряжения экспрессии исcледованных белков в этом отделе
мозга.
Открытым
оставался
вопрос
о
факторах,
определяющих
региональные
особенности экспрессии белков апоптоза в развивающемся мозге. В соответствие с
нейротрофической теорией развития мозга нейроны, избыточно закладывающиеся в
раннем онтогенезе, конкурируют за трофические факторы, и те из них, что не
получили трофическую поддержку, избирательно элиминируются путем апоптоза
(Oppenheim, 1991; Purves et al., 1988). Нейротрофины влияют на экспрессию ряда Bcl2 подобных белков в опытах in vitro (Lu et al., 2005). К примеру, добавление в
культуру PC12 нейронов NGF вызывает десятикратное снижение уровня экспрессии в
них проапоптозного белка Bax уже через 72 часа, однако не влияет при этом на
уровень антиапоптозного белка Bcl-XL (Vekrellis et al., 1997). Помимо этого,
возможно
также
и,
например,
белок-белковое
взаимодействие
GR
с
Trk-
нейротрофиновыми рецепторами, в конечном итоге также приводящее к изменению
уровней белков, определяющих жизнеспособность клеток (Numakawa et al., 2009). В
ЦНС наибольший нейротрофический вклад вносит BDNF (Hofer and Barde, 1988).
Зрелый BDNF в экспериментах in vitro способствует стимуляции экспрессии
антиапоптозных членов Bcl-2 семейства белков и ингибирует процессы активации
основной исполнительной протеазы апоптоза – каспазы-3, в то время как pro-BDNF,
94
напротив, индуцирует её активацию (Koshimizu et al., 2010; Renton et al., 2010).
Однако о действии подобных регуляторных механизмов экспрессии in vivo в ходе
формирования центральной нервной системы млекопитающих до последнего времени
можно было лишь предполагать.
Полученные в работе межрегиональные различия по уровню нейротрофина
согласуются со сведениями об уровнях мРНК BDNF (Das et al., 2001; Friedman et al.,
1991; Maisonpierre et al., 1990) и его концентрации (Das et al., 2001; Heaton et al., 2000;
Katoh-Semba et al., 1997) в структурах неонатального мозга. В дополнение к этим
данным обнаружено, что не столько сами по себе уровни mat-BDNF и pro-BDNF, как
их соотношение является важным фактором, определяющим склонность клеток к
вступлению в апоптоз в ходе онтогенеза.
Структуры головного мозга развиваются гетерохронно, в связи с этим в ходе
онтогенеза содержание нейротрофических факторов в них неодинаково, что, в свою
очередь, может приводить к различиям в периодах пиков физиологического апоптоза
избыточно закладывающихся нервных клеток этих структур (Meier et al., 2000). Ствол
как наиболее сформированная к концу первой недели жизни структура мозга в эти
сроки характеризуется низкой интенсивностью апоптоза (White and Barone, 2001). В
стволовой части мозга BDNF экспрессируется уже в первые дни постнатального
онтогенеза крыс (Friedman et al., 1991; Rocamora et al., 1993). Обнаруженное в работе
высокое соотношение mat-BDNF/pro-BDNF в этой структуре мозга, согласно
функциям данных форм нейротрофина, способно привести к снижению содержания
активной каспазы-3 у 8-дневных животных. В мозжечке пик апоптоза наблюдается
позже исследованного в работе возраста – на 10 и 20-й дни онтогенеза (White and
Barone, 2001), что в более раннем периоде, исследованном в работе, очевидно,
проявляется низким уровнем активной каспазы-3 (Menshanov et al., 2006) и
соответственно высоким соотношением mat-BDNF/pro-BDNF в этом отделе мозга, как
и в стволе.
Гиппокамп как структура наиболее пластичная в течение всей жизни индивида
имеет более высокий, чем в стволе, однако существенно более низкий, чем в коре
мозга, уровень апоптоза уже в первую неделю постнатального онтогенеза (White and
95
Barone, 2001). В гиппокампе взрослых животных содержание мРНК BDNF наиболее
высокое по сравнению с другими структурами (Das et al., 2001; Zhou et al., 1996).
Однако в первые дни после рождения экспрессия этого фактора находится на низком
уровне и достигает значений, сопоставимых с уровнем у взрослых в СА3 области
гиппокампа лишь к 10-му дню, а в СА4 области и зубчатой извилине – ко второй
неделе постнатального онтогенеза (Friedman et al., 1991; Maisonpierre et al., 1990).
В коре головного мозга в исследованный период развития наиболее выражено
влияние проапоптозных процессов и усилена экспрессия проапоптозных белков
(Menshanov et al., 2006; White and Barone, 2001). Крайне низкое соотношение matBDNF/pro-BDNF в коре мозга у неонатальных животных соответствует самому
высокому среди исследованных регионов мозга уровню активной каспазы-3.
Различия в экcпрессии про- и зрелого BDNF в отделах мозга неонатальных
крысят могут быть обусловлены особенностями регуляции их содержания в клетках и
межклеточном пространстве на разных этапах образования зрелого белка. Целый
набор транскрипционных факторов регулирует экспрессию гена BDNF, в числе
которых CREB, USF1/2 и CaRF, различия в экспрессии этих факторов способны
опосредовать разницу в уровнях BDNF (Aid et al., 2007). Важную роль в определении
баланса форм BDNF также играют процессы посттрансляционной модификации proBDNF с отщеплением продомена и превращением в зрелый белок, которая
осуществляется конвертазами прогормонов PC1 и PC2 в секреторных гранулах (Lu et
al., 2005). Несмотря на некоторые межрегиональные особенности, эти конвертазы
экспрессируются в развивающемся мозге на примерно сходном уровне во всех
отделах (Lee et al., 1999).
Различия в уровнях форм мозгового нейротрофического фактора между
регионами головного мозга потенциально способны приводить к различиям итогового
эффекта BDNF (Bibel and Barde, 2000), в частности на уровень активной каспазы-3.
Ясно, что итог действия BDNF и его проформы в отделах мозга напрямую связан
также и с уровнями экспрессии рецепторов TrkB и p75NTR в этих структурах. Эти два
типа рецепторов экспрессируются в мозге повсеместно (Merlio et al., 1992; Yan et al.,
1997). Хотя в их экспрессии и имеются некоторые межрегиональные особенности
96
(Koh and Higgins, 1991; Yan et al., 1997), однако, судя по данным литературы, они, по
крайней мере, в норме, не вносят весомого вклада в соотношение эффектов mat-BDNF
и pro-BDNF на уровни активной каспазы-3 в исследованных отделах неонатального
мозга (Koshimizu et al., 2009). В целом, результаты работы свидетельствуют, что в
ходе раннего онтогенеза структуры мозга, в которых активно элиминируются клетки и
относительно
высок
уровень
активной
каспазы-3,
характеризуются
низким
соотношением mat-BDNF/pro-BDNF, а структуры мозга с более низким уровнем
активной каспазы-3, напротив, характеризуются более высоким уровнем mat-BDNF и
высоким соотношением mat-BDNF/pro-BDNF. Иными словами, не только собственно
BDNF, но и его проформа, а также, очевидно, главным образом их соотношение
важны для определения судьбы клеток формирующегося головного мозга.
Таким образом, соотношение зрелой и про- форм BDNF в отделах мозга
неонатальных крысят, впервые описанное в работе, демонстрирует обратную
зависимость относительно уровня активной каспазы-3 в этих отделах. Различия
структур мозга неонатальных крысят по уровню форм нейротрофина и каспазы-3
может быть связано с их неодинаковой степенью зрелости и сформированности к
моменту исследования (Oppenheim, 1991).
Такой результат свидетельствует о возможном установлении регуляторных
влияний форм BDNF на уровни, по крайней мере, некоторых основных белков
апоптозного каскада в развивающемся мозге 8-дневных животных. Однако подобные
влияния скорее всего проявляются уже после 3-его дня постнатального онтогенеза.
Предпосылкой
для
данного
утверждения
служит
то,
что
при
наличии
межрегиональных различий в уровнях апоптозных белков на 3-ий день жизни крысят,
мы не выявили различий в содержании форм BDNF между отделами мозга.
Другими факторами, потенциально способными влиять на экспрессию белков
апоптоза в ранний постнатальный период развития, могут быть гормоны стресса,
оказывающие мощное влияние на мозг в критические пероиды эмбрионального и
раннего постнатального онтогенеза (Naumenko, Dygalo, 1980; Edwards and Burnham,
2001). В течение первых двух недель постнатального онтогенеза, называемыми
стресс-гипореактивным периодом (stress hyporesponsive period), надпочечники крыс
97
продуцируют малые количества глюкокортикоидов (Sapolsky and Meaney, 1986). В эти
сроки пролиферация и миграция клеток во многих отделах мозга, таких как
гиппокамп,
достигают
максимальных
величин,
и
сниженный
уровень
глюкокортикоидов, по мнению некоторых авторов (Gould et al., 1991), не оказывает на
эти процессы угнетающего действия. Как раз в этот период повышенные
концентрации гормонов стресса и способны оказывать наиболее ярко выраженное
влияние на процессы элиминации клеток и вносить серьёзные изменения в структуру
нервной системы, нейрохимию мозга и поведение животных (Naumenko, Dygalo, 1980;
Дыгало, 1993). Эффекты глюкокортикоидов на развивающуюся ЦНС, по крайней мере
частично,
могут
быть
связаны
с
регуляцией
этими
гормонами
процесса
программируемой гибели клеток.
Известно,
что
гормоны
стресса
индуцируют
апоптоз
клеток
многих
периферических тканей: лимфоцитов, эозинофилов, миобластов и остеобластов (Chae
et al., 2000), остеоцитов (Weinstein et al., 2000), хондроцитов (Chrysis et al., 2005).
Также показано, что введение дексаметазона стимулирует апоптоз в отдельных зонах
гиппокампа у взрослых крыс (Haynes et al., 2001). Однако глюкокортикоиды могут
выступать в в некоторых органах, тканях и опухолях качестве супрессоров апоптоза
(Costas et al., 2000). Тем не менее, несмотря на имеющиеся в литературе сведения о
влиянии гормонов стресса на жизнеспособность нервных клеток (Edwards and
Burnham, 2001; Tuor et al., 1997), их вклад в регуляцию апоптоза в развивающемся
мозге до сих пор остается малоизученным.
Часто используемым приемом для анализа этой проблемы является введение
экзогенных гормонов. Используемые в работе дозы гормональных препаратов
соответствуют применяемым в клинической практике перинатальной медицины.
Гормоны
в
аналогичных
дозах
также
наиболее
часто
используются
и
в
экспериментальных работах (Choy et al., 2008; Jobe et al., 2009). Такие дозы являются
эффективными с точки зрения влияния на интегральные показатели действия
глюкокортикоидов, таких как изменение массы тела, а также на уровни экспрессии
различных белков (Choy et al., 2008).
98
Мы не обнаружили эффектов дексаметазона или гидрокортизона на уровни
анализируемых белков у 3-дневных животных ни в одной из исследуемых структур
мозга.
О
сниженной
жизнеспособность
клеток,
чувствительности
к
генов
глюкокортикоидам
белков,
в
этот
определяющих
период
развития
свидетельствует и данные других работ. Например, группа немецких исследователей
не обнаружила существенных изменений экспрессии BDNF как в гиппокампе, так и в
области перегородки 4-дневных крыс под влиянием гидрокортизона (Roskoden et al.,
2004), что может быть обусловлено низким содержанием глюкокортикоидных и
минералокортикоидных рецепторов в мозге в этот период развития (Yi et al., 1994).
В коре головного мозга 8-дневных животных, также как и в 3-дневном возрасте,
не было отмечено значительных эффектов глюкокортикоидов на экспрессию белков
апоптоза и форм мозгового нейротрофического фактора. Аналогично с действием
гормона, и хронический стресс не влиял на уровень BDNF в коре крысят ранее 20-го
дня постнатального развития (Hairston et al., 2004).
В отличие от всех исследованных отделов мозга 3-дневных и коры 8-дневных
крысят, в стволе головного мозга 8-дневных животных под влиянием гидрокортизона
выявлено заметное, ранее неизвестное, повышение уровня прокаспазы-3, которое,
однако, не сопровождалось ростом уровня активной формы этой основной протеазы
апоптоза. Вероятно, это увеличение пула прокаспазы-3 в стволе мозга не связано с
физиологической элиминацией клеток, а может быть резервным на случай
патологических
состояний.
В
пользу
этого
свидетельствует
возможность
фармакологической индукции клонидином каспазо-зависимого апоптоза в этом отделе
неонатального мозга (Dygalo et al., 2004). К тому же, у крыс основные этапы
формирования ствола мозга проходят ещё до рождения (Oppenheim, 1991), с чем и
может быть связано отсутствие ярких эффектов глюкокортикоидов на экспрессию
большинства анализируемых белков в этой структуре развивающегося головного
мозга.
Известно, что глюкокортикоиды реализуют своё действие путем связывания с
минерало- и глюкокортикоидными рецепторами, которые, в свою очередь, являются
транскрипционными факторами и оказывают влияние на экпрессию множества генов
99
(de Kloet et al., 2005). Глюкокортикоиды способны изменять уровни экспрессии генов,
связанных с процессом апоптоза: к примеру, увеличивать содержание различных
изоформ проапоптозных белков Bim и Puma (Sionov et al., 2006b). В экспериментах in
vitro и при рассмотрении экспрессии белков во взрослом мозге показано, что
антиапоптозные эффекты гормонов стресса преимущественно реализуются через MR,
в то время как проапоптозные – через GR (Nair et al., 2004; Roy and Sapolsky, 2003). В
гиппокампе, в отличие от ствола и коры головного мозга, экспрессируются оба типа
рецепторов глюкокортикоидов (Gould et al., 1994). Краткосрочные эффекты MR
способствуют повышению возбудимости клеток нервных сетей этого региона мозга и
стабилизации процессов их функционирования, а GR нивелируют данные эффекты,
направляя изменения в сторону долгосрочной адаптации к стрессовому воздействию
(de Kloet et al., 2009). На уровне нейропластических процессов это выражается в том,
что активация GR приводит к пагубным для клеток последствиям, таким как атрофия
дендритов и, возможно, апоптоз (Crochemore et al., 2005). К тому же показано, что в
гиппокампе взрослых животных, стимуляция MR изменяет баланс белков Bcl-2
семейства в пользу антиапоптозных, а стимуляция GR смещает это соотношение в
пользу проапоптозных белков (Almeida et al., 2000). Однако существует ли подобная
закономерность в развивающемся мозге, до настоящего времени оставалось
неизвестным.
Отмечаемые в литературе различия эффектов глюкокортикоидов в разных
регионах головного мозга могут быть обусловлены, в частности, тем, что динамика
транслокации MR и GR в клеточное ядро зависит как от области мозга, так и типа
рецепторов (Sarabdjitsingh et al., 2009), что может обеспечивать особенности влияния
гормонов стресса на экспрессию белков апоптозного каскада в разных отделах мозга.
Гиппокамп, благодаря широкому представлению обоих типов рецепторов
глюкокортикоидов, по-видимому, потенциально более чутко реагирует на действие
глюкокортикоидов, которые связываются и с GR, и с MR (de Kloet et al., 2009). К тому
же, в этом отделе мозга имеет место уникальная NF-kB-зависимая стимуляция
экспрессии гена белка Bcl-XL (Qiu et al., 2001). В нашей работе впервые показано
наличие антипоптозных эффектов естественного глюкокортикоида гидрокортизона,
100
являющегося активатором MR и GR, в гиппокампе 8-дневных крысят. Под влиянием
гидрокортизона в гиппокампе 8-дневных крысят имело место значительное снижение
содержания незрелой формы мозгового нейротрофического фактора – pro-BDNF, по
многочисленным данным оказывающей проапоптозное влияние. В ряде работ был
показан супрессивный эффект глюкокортикоидов на экспрессию мРНК BDNF у
взрослых животных (Chao et al., 1998; Schaaf et al., 1998), в целом подтверждающий
результаты, полученные нами у неонатальных крысят. К примеру, хронический стресс
(de Quervain et al., 1998; Duman and Monteggia, 2006) или воздействие повышенным
уровнем экзогенных глюкокортикоидов (Nicholas et al., 2006) приводит к снижению
экспрессии мРНК BDNF в различных регионах мозга (Schaaf et al., 1999), в
особенности, в гиппокампе (Hossain et al., 2008; Nitta et al., 1999). Эти изменения у
взрослых животных можно обнаружить уже через 4-8 часов после повышения уровня
глюкокортикоидов в крови (Hansson et al., 2006). В нашем исследовании введение
гормона 8-дневным животным снижает уровень pro-BDNF, не влияя на уровень
зрелого белка, чему также находятся подтверждения в работах других исследователей,
проведенных на взрослых животных (Barbany and Persson, 1992). По всей вероятности
уровень зрелого BDNF напрямую не связан с содержанием его проформы, так как
зависит от дополнительных факторов, контролирующих перевод незрелой формы
нейротрофина в зрелую (Lu et al., 2005). Снижение уровня незрелой формы BDNF,
обладающей проапоптозным действием, возможно является промежуточным этапом
регуляции
экспрессии
белков
апоптоза
гидрокортизоном
в
развивающемся
гиппокампе.
Нами было обнаружено, что введение этого гормона вызывает повышение
уровня антиапоптозного регуляторного белка Bcl-XL в этой структуре мозга, а также
приводит к значительному снижению уровня основной эффекторной протеазы
апоптоза – каспазы-3, и её проэнзима – прокаспазы-3. В отличие от ствола мозга, в
гиппокампе в первые недели после рождения крысы продолжаются активные
процессы формирования его структуры, в частности элиминации клеток путем
апоптоза (Crochemore et al., 2005), что может быть причиной особенностей эффектов
гидрокортизона на уровень прокаспазы-3 в этих двух отделах мозга.
101
В отличие от гидрокортизона, его синтетический аналог дексаметазон
преимущественно связывается с GR рецепторами. В первые недели постнатального
развития экспрессия GR низка в сравнении с её уровнями во взрослом мозге, что
установлено рядом работ (Meaney et al., 1985; Yi et al., 1994). Именно с этим, повидимому, и может быть свзяно отсутствие эффектов дексаметазона на экспрессию
белков апоптоза и форм мозгового нейротрофического фактора в гиппокампе, стволе
и коре мозга неонатальных крыс. Другое возможное объяснение заключается в том,
что дексаметазон оказывает селективное влияние только на определенные клеточные
типы и популяции: к примеру, дексаметазон влияет на экспрессию апоптозассоцированного гена Ndrg2 в астроцитах крысы, но не в других клетках головного
мозга (Takahashi et al., 2012).
Наблюдаемые в нашей работе последствия введения гормонов на экспрессию
белков апотоза и форм BDNF в отделах мозга в исследованные дни жизни крыс, в
целом хорошо согласуются с особенностями экспрессии гормональных рецепторов в
эти сроки онтогенеза. Плотность MR, например, в гиппокампе низка в первые дни
жизни и резко увеличивается в конце первой недели после рождения, достигая
величин, сопоставимых с показателями у взрослых особей (Edwards and Burnham,
2001; Yi et al., 1994). Поэтому, в основе обнаруженных в нашей работе
межрегиональных и возрастных различий эффектов гормонов, могут лежать
особенности экспрессии MR в развивающемся мозге. Действительно, на 3-й день
экспрессия MR низка, и их числа, очевидно, недостаточно для того, чтобы
глюкокортикоиды могли оказать свое влияние через эти рецепторы, а к 8-му дню
жизни плотность MR возрастает, и их количества уже может быть вполне достаточно
для
проявления
антиапоптозного
действия
гидрокортизона.
Таким
образом,
глюкокортикоиды, связывающиеся с MR и GR, способны оказывать антиапоптозные
эффекты на экспрессию белков апоптозного каскада в гиппокампе, в те сроки
онтогенеза, когда экспрессия MR уже относительно высока.
Дексаметазон, действующий преимущественно через GR, не изменял уровни
про- и активной форм каспазы-3 в гиппокампе, коре и стволе мозга 3-дневных крысят
ни через 6, ни через 24 часа после введения гормона. В связи с этим можно
102
предполагать, что дексаметазон не способен напрямую регулировать экспрессию и
активацию каспазы-3 в этих отделах неонатального мозга. Подтверждениями для
данного предположения могут служить результаты работ других исследователей, в
которых отмечено, что действие глюкокортикоидов не приводит к серьёзным
нарушениям морфолигии и нейрогенеза в формирующемся мозге в течение первых
часов после инъекции этих гормонов (Duksal et al., 2009; Kanagawa et al., 2006).
Однако в литературе имеется достаточное количество доказательств существования
непрямой отложенной регуляции глюкокортикоидами уровней различных, в том числе
участвующих в реализации программируемой гибели нервных клеток, белков (Soga et
al., 2012; Takahashi et al., 2012; Zuloaga et al., 2012a).
Обнаруженное в нашей работе увеличение уровня активной каспазы-3 в коре
мозга через 120 часов после введения дексаметазона свидетельствует о наличии
опосредованных механизмов влияния глюкокортикоидов на активацию основной
эффекторной протеазы апоптоза в развивающемся мозге. Подобная отложенная
активация каспазы-3 в миндалине 4-6-дневных крысят под действием дексаметазона
была также отмечена в проведенной одновременно с нами недавней работе другого
исследовательского коллектива (Zuloaga et al., 2012a), что свидетельствует о
функционировании данного пути регуляции не только в коре, но и в других
структурах развивающегося мозга. Отложенный апоптоз, имеющий место вследствие
такой активации, может быть обусловлен первичной индукцией экспрессии
глюкокортикоидами других генов, например, α2-адренергических рецепторов,
стимуляция которых приводит к увеличению уровней активной каспазы-3 в клетках
(Dygalo et al., 2004). Этот или другие сходные клеточные механизмы, по-видимому,
способны вносить свой вклад в регуляцию процессов апоптоза при действии таких
повреждающих факторов, как гипоксия, которая может влиять на интенсивность
апоптоза не только в первые часы после воздействия, но и в более отложенные сроки
(Nakajima et al., 2000).
Особенности совместного влияния глюкокортикоидов и гипоксии на уровни
белков апоптоза в развивающемся мозге представляют большой интерес в связи с
применением этих гормонов для устранения респираторного дистресс-синдрома,
103
часто сопрождаемого гипоксическим состоянием у новорожденного в первые часы
после рождения (Jobe et al., 2009). Неоднократно показано, что увеличение уровня
гормонов стресса в плазме крови в случае патологий, связанных с гипоксией, может
во взрослом мозге приводить либо к терапевтическим (Lafleur et al., 2003), либо к
усугубляющим последствиям (Roberts et al., 2004), в зависимости от времени
относительно
установления
патологического
состояния.
Перинатальная
глюкокортикоидная терапия, в зависимости от врачебных показаний, возможна как до
родов – матери, так и после – новорожденному (Jobe et al., 2009; Zuloaga et al., 2012b).
В случае осложненных родов, зачастую сопровождаемых гипоксией, увеличение
уровня гормонов стресса в крови новорожденного соответственно либо предшествует,
либо следует после гипоксического эпизода. Наша задача состояла в том, чтобы
определить какой из двух этих вариантов применения глюкокортикоидных гормонов
является менее повреждающим с точки зрения стимуляции ими склонности клеток
формирующегося мозга к самоуничтожению.
Интегральным показателем действия глюкокортикоидов, а также отражением их
катаболического эффекта является снижение ими прироста веса тела животных (He et
al., 2004). Наши результаты не шли в разрез с этой широко освещенной в литературе
закономерностью, и дексаметазон заметно снижал прирост веса тела 3-дневных
крысят уже через 6 часов. Судя по данным ранее проведенных исследований как
хроническая, так и острая гипоксия также приводят к снижению прироста веса тела
неонатальных животных и новорожденных детей (Leal et al., 1995; Mortola et al., 1990).
Данный факт был также подтвержден в наших опытах, и гипоксия через 16 часов
достоверно снижала прирост веса тела животных.
После рассмотрения описанных выше эффектов дексаметазона и гипоксии на
интегральный показатель развития организма, следующим этапом нашей работы стала
оценка влияния этих воздействий на уровни белков апоптоза в мозге неонатальных
животных.
Гипоксия, как и глюкокортикоиды, способна изменять экспрессию про- и
антиапоптозных генов в нервных клетках, модулируя таким образом их склонность к
вступлению в апоптоз. При этом, в зависимости от степени воздействия и
104
сопутствующих условий, она способна приводить как к про-, так и к антиапоптозным
эффектам. В коре мозга взрослых крыс линнии Sprague-Dawley гипоксемия,
вызванная травмой головного мозга, приводит к снижению уровня антиапоптозного
белка Bcl-2 на фоне неизменной экспрессии проапоптозного Bax и антиапоптозного
Bcl-XL (Vlodavsky et al., 2005). На клетки гиппокампа умеренная гипоксия, напротив,
обладает антиапоптозным действием: она стимулирует экспрессию гена bcl-x
(Glasgow et al., 2001). Таким образом, влияния гипоксии на экспрессию белков
апоптозного каскада весьма разнообразны, и поэтому в нашем исследовании основное
внимание сосредоточено на ранее не исследованных, но важнейших с точки зрения
выживаемости клеток, эффектах острой гипоксии в отделах развивающегося мозга
млекопитающих.
Мы обнаружили стимуляцию экспрессии мРНК Bcl-XL, не сопроводавшуюся
изменением уровня белка, в стволовой части мозга под влиянием гипоксии. Ранее, в
промоторе гена bcl-x были обнаружены гипоксия-чувствительные элементы генома
(Chen et al., 2009), и было показано, что в гипоксических условиях он может являться
мишенью транскрипционной регуляции гипоксия-индуцируемого фактора HIF-1 (Chen
et al., 2011), что, возможно, и объясняет обнаруженный в нашей работе эффект
стимуляции экспрессии мРНК Bcl-XL дексаметазоном. Рост уровня мРНК Bcl-XL под
влиянием гипоксии не сопровождался, однако, увеличением содержания белка, что
может объясняться общим ингибированием процессов трансляции в условиях
гипоксии (Erler et al., 2004). Данный эффект является подтверждением вклада не
только транскрипция-ассоциированных, но и посттранскрипционных процессов, на
которые гипоксия способна оказывать разнонаправленные влияния, в регуляцию
сравнительно лабильных белков Bcl-2 семейства (Niture and Jaiswal, 2011; Xu et al.,
2011).
Помимо влияния на транскрипцию апоптоз-ассоцированных генов, в этом
отделе мозга гипоксия изменяла и уровни белков. Гипоксия проведенная за 22 часа до
забора материала приводила к антиапоптозным эффектам как сама по себе, так и при
введении дексаметазона через 16 часов после эпизода гипоксии: она, соответственно,
снижала уровни проапоптозных Bax и активной каспазы-3. Подобная «неспешность»
105
проявления эффектов гипоксии, по всей видимости, связана с динамикой её действия
на экспрессию генов в мозге (Xu et al., 2011). Таким образом, по результатам нашего
исследования можно заключить, что гипоксия способна оказывать антиапоптозное
действие на экспрессию белков в стволе мозга неонатальных животных.
Важная проблема, которую необходимо изучить, заключается в особенностях
действия
глюкокортикоидов
на
экспрессию
белков
апоптоза
на
фоне
предшествующего или последующего действия острой гипоксии в неонатальный
период развития. Ранее неоднократно были отмечены позитивные эффекты
превентивного введения глюкокортикодов во взрослом мозге, в частности, при отеках
мозга в случае «высотной болезни» (mountain sickness) (Johnson et al., 1984; Lafleur et
al., 2003), а также на моделях патологических состояний неонатального мозга, таких
как гипоксия-ишемия (Chumas et al., 1993). В этом случае действие гормонов стресса
можно
расценивать
как защищающее
против
последующего гипоксического
воздействия. Оно проявляется в изменении уровней экспрессии транскрипционных
факторов (Macaya et al., 1998) и степени их фосфорилирования (Harms et al., 2007),
поддержании синтеза белка в условиях гипоксии (Carlos et al., 1991), а также
активации ферментов-антиоксидантов и повышении уровня глюкозы в крови (Tuor et
al., 1993).
Повышение уровня глюкокортикоидов после гипоксического эпизода, напротив,
создает почву для негативных последствий, и в случае инсульта приводит к
увеличению степени повреждения мозга и процента летальных исходов (Robertson et
al., 1994). Даже кратковременное воздействие глюкокортикоидов может вызывать
повреждения нейронов вследствие изменения глутаматэргической нейротрансмиссии
(Armanini et al., 1990), увеличения внеклеточной концентрации глутамата (SteinBehrens et al., 1994) и внутриклеточного уровня кальция (Karst et al., 1994).
Неоднократно
установлено,
что
деструктивные
эффекты
высокого
уровня
глюкокортикоидов на мозг опосредованы GR (Mulholland et al., 2004; Packan and
Sapolsky, 1990), а их избыточная активация способствует усугублению негативных
последствий гипоксии (Sandau and Handa, 2007), и может приводить к апоптозу клеток
мозга (Almeida et al., 2000; Crochemore et al., 2005). В своей работе мы, как и другие
106
исследователи (Felszeghy et al., 1996), обнаружили, что дексаметазон уже через 6
часов снижает содержание глюкокортикоидных рецепторов в коре головного мозга.
Гипоксия же ни через 6, ни через 10 часов сама по себе не изменяла уровень GR в
заметной мере, что подтверждается результатами других работ на более длительных
временных промежутках (Rogalska et al., 2009). При этом действие гипоксии перед
введением дексаметазона не могло устранить эффект снижения экспрессии
глюкокортикоидных рецепторов, а её постгормональное воздействие приводило к
восстановлению нормального уровня этого белка в коре мозга 3-дневных животных.
Подобное взаимодействие эффектов гипоксии и глюкокортикоидов ранее не описано в
литературе и представляет собой интересный с научной и медицинской точек зрения
факт. Наличие изменений уровня GR в коре мозга, но не в других его отделах, может
быть связано с тем, что 1А транскрипт GR, вовлеченный в глюкокортикоидиндуцируемый апоптоз, в мозге в основном экспрессируется именно в коре (Sionov et
al., 2006b). Происходящее в коре головного мозга снижение экспрессии GR не
сопровождалось, однако, изменениями уровней потенциальных мишеней его
регуляции – исследованных в работе белков апоптозного каскада, что может быть
обусловлено вкладом других регуляторов, таких как, например, NF-κβ, в поддержание
их уровней (Nijboer et al., 2008).
Регуляция
экспрессии
мРНК
генов
глюкокортикоидами
может
быть
ассоциирована с действием гипоксии: гены c GRE в промотарах широко представлены
среди тех, экспрессия которых индуцируется после гипоксии (Furay et al., 2008; Xu et
al., 2011). В промоторе гена bcl-x находятся гормон-отвечающие элементы (GRE), и он
является мишенью транскриционной регуляции глюкокортикоидными рецепторами
(Gascoyne et al., 2003; Parsadanian et al., 1998; Viegas et al., 2004). Судя по сведениям
литературы, дексаметазон, реализующий своё действие преимущественно через GR,
стимулирует экспрессию гена bcl-x (Petrella et al., 2006; Schorr and Furth, 2000). В
нашей работе мы подвердили, что этот гормон вызывает полуторакратное увеличение
экспрессии мРНК Bcl-XL уже через 6 часов. Однако, стимуляция экспрессии мРНК
Bcl-XL в стволе мозга дексаметазоном очевидно не связана с увеличением уровня GR,
экспрессия которых не изменялась. В случае совместного влияния гипоксии и
107
дексаметазона увеличение экспрессии мРНК Bcl-XL выражено ещё значительней, что
может быть обусловлено усилением глюкокортикоидами экспрессии HIF-1-зависимых
генов путем прямого взаимодействия GR с HIF-1α (Kodama et al., 2003).
В отличие от мРНК, уровень белка Bcl-XL не повысился у животных, которым
инъецировали дексаметазон. Как и в случае с гипоксией, здесь имеет место
рассогласование последствий влияния дексаметазона на транскрипционный и
посттранскрипционный уровни регуляции количества белка (Wang et al., 2002). В
стволе мозга неонатальных животных в наших опытах наблюдалось достоверное
снижение содержания антиапоптозного белка Bcl-XL под влиянием дексаметазона и
предшествующей за 4 часа гипоксии. Тенденция к аналогичным изменениям
проявлялась и в гиппокампе. Данный эффект может быть связан с ускорением распада
белков под действием глюкокортикоидов (Sun et al., 2007). При этом увеличение
синтеза этого довольно долгоживущего в нормальных условиях (24h) белка (Merino et
al., 1994; Merry and Korsmeyer, 1997) не способно компенсировать его ускоренный
распад. Более того, вероятно, речь идет о селективном ускорении протеолиза Bcl-XL,
распад которого контролируется специфичными для него белками деградации, не
влияющими на протеолиз других белков Bcl-2 семейства (Magiera et al., 2013; Niture
and Jaiswal, 2011). Не исключено, что глюкокортикоиды при действии после
гипоксического эпизода способны изменять экспрессию или активность белков,
контролирующих распад Bcl-XL, таким образом, специфически стимулируя его
протеолиз. Подобная ускоренная селективная деградация антиапоптозных белков
была не раз продемонстрирована в опытах in vitro на лейкоцитарных клетках (Adams
and Cooper, 2007; Marshansky et al., 2001). К тому же, вклад в реализацию
обнаруженного эффекта могут давать неселективные процессы активации протеасомы
под действием глюкокортикоидов, происходящие как в клетках лейкоцитарного ряда
(Dallaporta et al., 2000), так и в культивируемых нейронах гиппокампа (Wang et al.,
2002). Результаты нашей работы могут косвенно свидетельствовать о процессах
селективной деградации антиапоптозного белка Bcl-XL in vivo в головном мозге,
которая реализуется при постгипоксическом введении дексаметазона.
108
Таким образом, в работе впервые установлено, что дексаметазон, действуя в
перинатальном периоде после эпизода гипоксии, способен изменять содержание
белков апоптозного каскада и регуляторов их экспрессии в неонатальном мозге в
проапоптозную сторону, тогда как предварительное введение гормона не приводит к
подобным
сдвигам.
Этот
эффект
синтетического
аналога
глюкокортикоидов
проявляется в разных регионах мозга в различной степени. Одной из возможных
причин межрегиональных различий может быть то, что в гиппокампе и коре
плотность рецепторов глюкокортикоидов выше, чем в стволе мозга (Miklos and
Kovacs, 2002), и введенная нами доза дексаметазона,
недостаточной
для
значительного
изменения
очевидно, оказалась
суммарной
транскрипционной
активности этих рецепторов в промоторах генов изучаемых нами белков в гиппокампе
и коре больших полушарий. Наряду с этим, очевидно присутствует и адаптационный
аспект подобных региональных особенностей экспрессии белков: ствол мозга, в
отличие от других исследованных нами структур, содержит в своём составе
важнейшие дыхательные центры, которым необходимо чутко реагировать на
изменение содержания кислорода в ткани мозга и на ранних стадиях онтогенеза
изменять в своем составе размеры и представительство клеточных популяций в ответ
на гипоксию (Peng et al., 2006; Tomimatsu et al., 2002).
Результаты
работы
свидетельствуют,
что
введение
синтетических
глюкокортикоидов после эпизода аноксии в регион-специфичной манере смещает
уровни белков апоптозного каскада и их регуляторов в проапоптозную сторону, чего
не наблюдается при предгипоксическом введении этих гормонов. Иными словами,
предварительное применение глюкокортикоидов менее губительно для клеток
формирующегося мозга, чем их пост-гипоксическое послеродовое применение.
В целом, результаты работы свидетельствуют, что экспрессия белков апоптоза в
ростральных отделах развивающегося головного мозга (гиппокамп), в отличие от
каудальных
(ствол
мозга)
его
отделов
имеет
высокую
степень
взаимной
сопряженности. Регулирующее влияние форм BDNF на их уровни устанавливается не
сразу после рождения, а, как минимум, после 3-его дня постнатального онтогенеза.
Сами по себе гипоксия и гормоны стресса способны приводить к потенциально
109
увеличивающим жизнеспособность клеток изменениям уровней белков апоптозного
каскада в неоднородных по их содержанию отделах формирующегося мозга. Однако
при наложении влияний глюкокортикоидов на эффекты предшествующей гипоксии
наблюдаются проапоптозные сдвиги уровней белков, не обнаруживаемые при
предгипоксическом
действии
гормонов.
Иными
словами,
предварительное
применение глюкокортикоидов менее губительно для клеток формирующегося мозга,
чем их пост-гипоксическое применение.
110
ВЫВОДЫ
1. Уровень антиапоптозного белка Bcl-XL в гиппокампе 3-дневных животных
отрицательно коррелирует с содержанием проапоптозного белка Bax и активной
каспазы-3. Уровни белка Bax и активной каспазы-3 в этом отделе мозга
положительно коррелируют между собой, что свидетельствует о координированной
экспрессии белков апоптозного каскада в неонатальном гиппокампе.
2. Соотношение mat-BDNF к pro-BDNF и содержание активной каспазы-3 в отделах
мозга 8-дневных крысят находятся в обратной зависимости. Стволовая часть мозга и
мозжечок с высокой величиной соотношения mat-BDNF/pro-BDNF характеризуются
низким содержанием активной каспазы-3. Гиппокамп и кора мозга с низкой
величиной данного отношения обладают высоким уровнем активной каспазы-3.
Каждая из форм BDNF в отдельности такой взаимосвязи с активной каспазой-3 не
проявляет.
3.
Гидрокортизон через 6 часов его после введения повышает уровень
антиапоптозного белка Bcl-XL и снижает уровни проапоптозных pro-BDNF,
прокаспазы-3 и активной каспазы-3 в гиппокампе 8-дневных животных.
Избирательный агонист GR дексаметазон такого влияния не оказывает.
4. Синтетический аналог естественных гормонов стресса дексаметазон способен
повышать уровень активной каспазы-3 в коре мозга неонатальных животных через
120 часов после введения гормона на 3-ий день жизни.
5. Гипоксия в неонатальный период развития оказывает антиапоптозое влияние на
уровни белков программируемой гибели клеток в стволовой части головного мозга.
Через 6 часов после этого воздействия в этом отделе мозга повышается экспрессия
мРНК антиапоптозного Bcl-XL и через 22 часа снижается уровень исполнительной
протеазы апоптоза активной каспазы-3.
6. Гипоксия и дексаметазон как по отдельности, так и при совместном применении
повышают уровень мРНК Bcl-XL в стволе неонатального головного мозга.
7. Между эффектами гипоксии и дексаметазона в раннем онтогенезе наблюдается
взаимодействие: характер последствий применения каждого из этих факторов
может зависеть от применения другого. Устойчивый к каждому из факторов в
отдельности уровень белка Bcl-XL снижается в стволе головного мозга при
введении дексаметазона после гипоксии. Дексаметазон, действуя после гипоксии,
снижает экспрессию глюкокортикоидных рецепторов в коре головного мозга, в то
время как применение гормона перед гипоксией к снижению не приводит.
8. В целом, в работе впервые установлена способность гипоксии и глюкокортикоидов
изменять уровни белков апоптоза в развивающемся головном мозге. Практически
полезной особенностью совместного влияния этих факторов может оказаться то, что
предгипоксическое применение дексаметазона, в отличие от постгипоксического, не
приводит к изменениям уровней ключевых белков апоптозного каскада.
111
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Дыгало Н.Н. Приобретение стероидами гормональных функций в эволюции и их
эффекты в раннем онтогенезе // Успехи современной биологии. 1993. Т. 113. № 2, С.
162-175.
2. Маниатис Т., Фринч Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Пер. с англ. –
М: Мир. – 1984.
3. Adams K.W., Cooper G.M. Rapid turnover of mcl-1 couples translation to cell survival and
apoptosis // J Biol Chem. 2007. V. 282. № 9. - P. 6192-200.
4. Adlard P.A., Cotman C.W. Voluntary exercise protects against stress-induced decreases in
brain-derived neurotrophic factor protein expression // Neuroscience. 2004. V. 124. № 4. - P.
985-92.
5. Aid T., Kazantseva A., Piirsoo M., Palm K., Timmusk T. Mouse and rat BDNF gene structure
and expression revisited // J Neurosci Res. 2007. V. 85. № 3. - P. 525-35.
6. Akhtar R.S., Ness J.M., Roth K.A. Bcl-2 family regulation of neuronal development and
neurodegeneration // Biochim Biophys Acta. 2004. V. 1644. № 2-3. - P. 189-203.
7. Alcantara S., Frisen J., del Rio J.A., Soriano E., Barbacid M., Silos-Santiago I. TrkB
signaling is required for postnatal survival of CNS neurons and protects hippocampal and
motor neurons from axotomy-induced cell death // J Neurosci. 1997. V. 17. № 10. - P. 362333.
8. Almeida O.F., Conde G.L., Crochemore C., Demeneix B.A., Fischer D., Hassan A.H., Meyer
M., Holsboer F., Michaelidis T.M. Subtle shifts in the ratio between pro- and antiapoptotic
molecules after activation of corticosteroid receptors decide neuronal fate // FASEB J. 2000.
V. 14. № 5. - P. 779-90.
9. Alonso G., Guillemain I., Dumoulin A., Privat A., Patey G. Immunolocalization of Bcl-xL/S
in the central nervous system of neonatal and adult rats // Cell Tissue Res. 1997. V. 288. №
1. - P. 59-68.
10. Antonsson B. Mitochondria and the Bcl-2 family proteins in apoptosis signaling pathways //
Mol Cell Biochem. 2004. V. 256-257. № 1-2. - P. 141-55.
112
11. Armanini M.P., Hutchins C., Stein B.A., Sapolsky R.M. Glucocorticoid endangerment of
hippocampal neurons is NMDA-receptor dependent // Brain Res. 1990. V. 532. № 1-2. - P.
7-12.
12. Baker S.A., Stanford L.E., Brown R.E., Hagg T. Maturation but not survival of
dopaminergic nigrostriatal neurons is affected in developing and aging BDNF-deficient mice
// Brain Res. 2005. V. 1039. № 1-2. - P. 177-88.
13. Barbany G., Persson H. Regulation of Neurotrophin mRNA Expression in the Rat Brain by
Glucocorticoids // Eur J Neurosci. 1992. V. 4. № 5. - P. 396-403.
14. Barde Y.A. Trophic factors and neuronal survival // Neuron. 1989. V. 2. № 6. - P. 1525-34.
15. Bartkowska K., Turlejski K., Djavadian R.L. Neurotrophins and their receptors in early
development of the mammalian nervous system // Acta Neurobiol Exp (Wars). 2010. V. 70.
№ 4. - P. 454-67.
16. Baud O., Sola A. Corticosteroids in perinatal medicine: how to improve outcomes without
affecting the developing brain? // Semin Fetal Neonatal Med. 2007. V. 12. № 4. - P. 273-9.
17. Benesova O., Pavlik A. Perinatal treatment with glucocorticoids and the risk of
maldevelopment of the brain // Neuropharmacology. 1989. V. 28. № 1. - P. 89-97.
18. Berger R., Garnier Y. Pathophysiology of perinatal brain damage // Brain Res Brain Res
Rev. 1999. V. 30. № 2. - P. 107-34.
19. Bernd P. The role of neurotrophins during early development // Gene Expr. 2008. V. 14. №
4. - P. 241-50.
20. Bianchi L.M., Conover J.C., Fritzsch B., DeChiara T., Lindsay R.M., Yancopoulos G.D.
Degeneration of vestibular neurons in late embryogenesis of both heterozygous and
homozygous BDNF null mutant mice // Development. 1996. V. 122. № 6. - P. 1965-73.
21. Bibel M., Barde Y.A. Neurotrophins: key regulators of cell fate and cell shape in the
vertebrate nervous system // Genes Dev. 2000. V. 14. № 23. - P. 2919-37.
22. Borner C. The Bcl-2 protein family: sensors and checkpoints for life-or-death decisions //
Mol Immunol. 2003. V. 39. № 11. - P. 615-47.
23. Bravo J.A., Diaz-Veliz G., Mora S., Ulloa J.L., Berthoud V.M., Morales P., Arancibia S.,
Fiedler J.L. Desipramine prevents stress-induced changes in depressive-like behavior and
hippocampal markers of neuroprotection // Behav Pharmacol. 2009. V. 20. № 3. - P. 273-85.
113
24. Buck C.R., Martinez H.J., Black I.B., Chao M.V. Developmentally regulated expression of
the nerve growth factor receptor gene in the periphery and brain // Proc Natl Acad Sci U S
A. 1987. V. 84. № 9. - P. 3060-3.
25. Bulygina V.V., Shishkina G.T., Berezova I.V., Dygalo N.N. BDNF protein expression in the
hippocampus following exposure of rats to forced swimming stress // Dokl Biol Sci. 2011.
V. 437. - P. 82-4.
26. Buttigieg H., Kawaja M.D., Fahnestock M. Neurotrophic activity of proNGF in vivo // Exp
Neurol. 2007. V. 204. № 2. - P. 832-5.
27. Carlos R.Q., Seidler F.J., Slotkin T.A. Fetal dexamethasone exposure sensitizes neonatal rat
brain to hypoxia: effects on protein and DNA synthesis // Brain Res Dev Brain Res. 1991. V.
64. № 1-2. - P. 161-6.
28. Chae H.J., Chae S.W., Kang J.S., Bang B.G., Cho S.B., Park R.K., So H.S., Kim Y.K., Kim
H.M., Kim H.R. Dexamethasone suppresses tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis
in osteoblasts: possible role for ceramide // Endocrinology. 2000. V. 141. № 8. - P. 2904-13.
29. Chao H.M., Sakai R.R., Ma L.Y., McEwen B.S. Adrenal steroid regulation of neurotrophic
factor expression in the rat hippocampus // Endocrinology. 1998. V. 139. № 7. - P. 3112-8.
30. Chao M.V. Neurotrophins and their receptors: a convergence point for many signalling
pathways // Nat Rev Neurosci. 2003. V. 4. № 4. - P. 299-309.
31. Chen C., Zhou H., Wei F., Jiang L., Liu X., Liu Z., Ma Q. Increased levels of hypoxiainducible factor-1alpha are associated with Bcl-xL expression, tumor apoptosis, and clinical
outcome in chondrosarcoma // J Orthop Res. 2011. V. 29. № 1. - P. 143-51.
32. Chen N., Chen X., Huang R., Zeng H., Gong J., Meng W., Lu Y., Zhao F., Wang L., Zhou
Q. BCL-xL is a target gene regulated by hypoxia-inducible factor-1{alpha} // J Biol Chem.
2009. V. 284. № 15. - P. 10004-12.
33. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium
thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal Biochem. 1987. V. 162. № 1. - P. 156-9.
34. Choy K.H., de Visser Y., Nichols N.R., van den Buuse M. Combined neonatal stress and
young-adult glucocorticoid stimulation in rats reduce BDNF expression in hippocampus:
effects on learning and memory // Hippocampus. 2008. V. 18. № 7. - P. 655-67.
114
35. Chrysis D., Zaman F., Chagin A.S., Takigawa M., Savendahl L. Dexamethasone induces
apoptosis in proliferative chondrocytes through activation of caspases and suppression of the
Akt-phosphatidylinositol 3'-kinase signaling pathway // Endocrinology. 2005. V. 146. № 3. P. 1391-7.
36. Chumas P.D., Del Bigio M.R., Drake J.M., Tuor U.I. A comparison of the protective effect
of dexamethasone to other potential prophylactic agents in a neonatal rat model of cerebral
hypoxia-ischemia // J Neurosurg. 1993. V. 79. № 3. - P. 414-20.
37. Costas M.A., Muller Igaz L., Holsboer F., Arzt E. Transrepression of NF-kappaB is not
required for glucocorticoid-mediated protection of TNF-alpha-induced apoptosis on
fibroblasts // Biochim Biophys Acta. 2000. V. 1499. № 1-2. - P. 122-129.
38. Crochemore C., Lu J., Wu Y., Liposits Z., Sousa N., Holsboer F., Almeida O.F. Direct
targeting of hippocampal neurons for apoptosis by glucocorticoids is reversible by
mineralocorticoid receptor activation // Mol Psychiatry. 2005. V. 10. № 8. - P. 790-8.
39. Dallaporta B., Pablo M., Maisse C., Daugas E., Loeffler M., Zamzami N., Kroemer G.
Proteasome activation as a critical event of thymocyte apoptosis // Cell Death Differ. 2000.
V. 7. № 4. - P. 368-73.
40. Das K.P., Chao S.L., White L.D., Haines W.T., Harry G.J., Tilson H.A., Barone S., Jr.
Differential patterns of nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor and
neurotrophin-3 mRNA and protein levels in developing regions of rat brain // Neuroscience.
2001. V. 103. № 3. - P. 739-61.
41. de Kloet E.R., Fitzsimons C.P., Datson N.A., Meijer O.C., Vreugdenhil E. Glucocorticoid
signaling and stress-related limbic susceptibility pathway: about receptors, transcription
machinery and microRNA // Brain Res. 2009. V. 1293. - P. 129-41.
42. de Kloet E.R., Joels M., Holsboer F. Stress and the brain: from adaptation to disease // Nat
Rev Neurosci. 2005. V. 6. № 6. - P. 463-75.
43. Dell'Anna M.E., Calzolari S., Molinari M., Iuvone L., Calimici R. Neonatal anoxia induces
transitory hyperactivity, permanent spatial memory deficits and CA1 cell density reduction
in developing rats // Behav Brain Res. 1991. V. 45. № 2.- P. 125-34.
44. de Quervain D.J., Roozendaal B., McGaugh J.L. Stress and glucocorticoids impair retrieval
of long-term spatial memory // Nature. 1998. V. 394. № 6695. - P. 787-90.
115
45. Degterev A., Boyce M., Yuan J. A decade of caspases // Oncogene. 2003. V. 22. № 53. - P.
8543-67.
46. Druilhe A., Letuve S., Pretolani M. Glucocorticoid-induced apoptosis in human eosinophils:
mechanisms of action // Apoptosis. 2003. V. 8. № 5. - P. 481-95.
47. Duksal F., Kilic I., Tufan A.C., Akdogan I. Effects of different corticosteroids on the brain
weight and hippocampal neuronal loss in rats // Brain Res. 2009. V. 1250. - P. 75-80.
48. Duman R.S., Monteggia L.M. A neurotrophic model for stress-related mood disorders //
Biol Psychiatry. 2006. V. 59. № 12. - P. 1116-27.
49. Dumas T.C., Gillette T., Ferguson D., Hamilton K., Sapolsky R.M. Anti-glucocorticoid gene
therapy reverses the impairing effects of elevated corticosterone on spatial memory,
hippocampal neuronal excitability, and synaptic plasticity // J Neurosci. 2010. V. 30. № 5. P. 1712-20.
50. Dupouy J.P., Chatelain A., Boudouresque F., Conte-Devolx B., Oliver C. Effects of chronic
maternal dexamethasone treatment on the hormones of the hypothalamo-pituitary-adrenal
axis in the rat fetus // Biol Neonate. 1987. V. 52. № 4. - P. 216-22.
51. Dygalo N.N., Bannova A.V., Kalinina T.S., Shishkina G.T. Clonidine increases caspase-3
mRNA level and DNA fragmentation in the developing rat brainstem // Brain Res Dev Brain
Res. 2004. V. 152. № 2. - P. 225-31.
52. Earnshaw W.C., Martins L.M., Kaufmann S.H. Mammalian caspases: structure, activation,
substrates, and functions during apoptosis // Annu Rev Biochem. 1999. V. 68. - P. 383-424.
53. Edwards H.E., Burnham W.M. The impact of corticosteroids on the developing animal //
Pediatr Res. 2001. V. 50. № 4. - P. 433-40.
54. Erler J.T., Cawthorne C.J., Williams K.J., Koritzinsky M., Wouters B.G., Wilson C., Miller
C., Demonacos C., Stratford I.J., Dive C. Hypoxia-mediated down-regulation of Bid and
Bax in tumors occurs via hypoxia-inducible factor 1-dependent and -independent
mechanisms and contributes to drug resistance // Mol Cell Biol. 2004. V. 24. № 7. - P. 287589.
55. Felszeghy K., Gaspar E., Nyakas C. Long-term selective down-regulation of brain
glucocorticoid receptors after neonatal dexamethasone treatment in rats // J
Neuroendocrinol. 1996. V. 8. № 7. - P. 493-9.
116
56. Friedman W.J., Ernfors P., Persson H. Transient and persistent expression of NT-3/HDNF
mRNA in the rat brain during postnatal development // J Neurosci. 1991. V. 11. № 6. - P.
1577-84.
57. Friedman W.J. Proneurotrophins, seizures, and neuronal apoptosis // Neuroscientist. 2010.
V. 16. № 3. - P. 244-52.
58. Fuchikami M., Morinobu S., Kurata A., Yamamoto S., Yamawaki S. Single immobilization
stress differentially alters the expression profile of transcripts of the brain-derived
neurotrophic factor (BDNF) gene and histone acetylation at its promoters in the rat
hippocampus // Int J Neuropsychopharmacol. 2009. V. 12. № 1. - P. 73-82.
59. Fulda S., Debatin K.M. Targeting inhibitor of apoptosis proteins (IAPs) for diagnosis and
treatment of human diseases // Recent Pat Anticancer Drug Discov. 2006. V. 1. № 1. - P. 819.
60. Funder J.W. Glucocorticoid receptors // J Steroid Biochem Mol Biol. 1992. V. 43. № 5. - P.
389-94.
61. Furay A.R., Bruestle A.E., Herman J.P. The role of the forebrain glucocorticoid receptor in
acute and chronic stress // Endocrinology. 2008. V. 149. № 11. - P. 5482-90.
62. Gardner D.S., Fletcher A.J., Fowden A.L., Giussani D.A. Plasma adrenocorticotropin and
cortisol concentrations during acute hypoxemia after a reversible period of adverse
intrauterine conditions in the ovine fetus during late gestation // Endocrinology. 2001. V.
142. № 2. - P. 589-98.
63. Gascoyne D.M., Kypta R.M., Vivanco M. Glucocorticoids inhibit apoptosis during
fibrosarcoma development by transcriptionally activating Bcl-xL // J Biol Chem. 2003. V.
278. № 20. - P. 18022-9.
64. Glasgow J.N., Qiu J., Rassin D., Grafe M., Wood T., Perez-Pol J.R. Transcriptional
regulation of the BCL-X gene by NF-kappaB is an element of hypoxic responses in the rat
brain // Neurochem Res. 2001. V. 26. № 6. - P. 647-59.
65. Gould E., Cameron H.A., McEwen B.S. Blockade of NMDA receptors increases cell death
and birth in the developing rat dentate gyrus // J Comp Neurol. 1994. V. 340. № 4. - P. 55165.
117
66. Gould E., Daniels D.C., Cameron H.A., McEwen B.S. Expression of adrenal steroid
receptors by newly born cells and pyknotic cells in the dentate gyrus of the postnatal rat //
Mol Cell Neurosci. 1992. V. 3. № 1. - P. 44-8.
67. Gould E., Woolley C.S., Cameron H.A., Daniels D.C., McEwen B.S. Adrenal steroids
regulate postnatal development of the rat dentate gyrus: II. Effects of glucocorticoids and
mineralocorticoids on cell birth // J Comp Neurol. 1991. V. 313. № 3. - P. 486-93.
68. Green D.R., Kroemer G. The pathophysiology of mitochondrial cell death // Science. 2004.
V. 305. № 5684. - P. 626-9.
69. Gupta C., Goldman A. H-2 histocompatibility region: influence on the murine
glucocorticoid receptor and its response // Science. 1982. V. 216. № 4549. - P. 994-6.
70. Hacker G., Weber A. BH3-only proteins trigger cytochrome c release, but how? // Arch
Biochem Biophys. 2007. V. 462. № 2. - P. 150-5.
71. Hagberg H., Mallard C., Rousset C.I., Xiaoyang W. Apoptotic mechanisms in the immature
brain: involvement of mitochondria // J Child Neurol. 2009. V. 24. № 9. - P. 1141-6.
72. Hager G.L., Lim C.S., Elbi C., Baumann C.T. Trafficking of nuclear receptors in living cells
// J Steroid Biochem Mol Biol. 2000. V. 74. № 5. - P. 249-54.
73. Hairston I.S., Peyron C., Denning D.P., Ruby N.F., Flores J., Sapolsky R.M., Heller H.C.,
O'Hara B.F. Sleep deprivation effects on growth factor expression in neonatal rats: a
potential role for BDNF in the mediation of delta power // J Neurophysiol. 2004. V. 91. № 4.
- P. 1586-95.
74. Hallbook F. Evolution of the vertebrate neurotrophin and Trk receptor gene families // Curr
Opin Neurobiol. 1999. V. 9. № 5. - P. 616-21.
75. Hamburger V. History of the discovery of neuronal death in embryos // J Neurobiol. 1992.
V. 23. № 9. - P. 1116-23.
76. Hansen D.K., Grafton T.F. Comparison of dexamethasone-induced embryotoxicity in vitro
in mouse and rat embryos // Teratog Carcinog Mutagen. 1994. V. 14. № 6. - P. 281-9.
77. Hansen D.K., LaBorde J.B., Wall K.S., Holson R.R., Young J.F. Pharmacokinetic
considerations of dexamethasone-induced developmental toxicity in rats // Toxicol Sci.
1999. V. 48. № 2. - P. 230-9.
118
78. Hansson A.C., Sommer W.H., Metsis M., Stromberg I., Agnati L.F., Fuxe K. Corticosterone
actions on the hippocampal brain-derived neurotrophic factor expression are mediated by
exon IV promoter // J Neuroendocrinol. 2006. V. 18. № 2. - P. 104-14.
79. Harms C., Albrecht K., Harms U., Seidel K., Hauck L., Baldinger T., Hubner D.,
Kronenberg G., An J., Ruscher K., Meisel A., Dirnagl U., von Harsdorf R., Endres M.,
Hortnagl H. Phosphatidylinositol 3-Akt-kinase-dependent phosphorylation of
p21(Waf1/Cip1) as a novel mechanism of neuroprotection by glucocorticoids // J Neurosci.
2007. V. 27. № 17. - P. 4562-71.
80. Haynes L.E., Griffiths M.R., Hyde R.E., Barber D.J., Mitchell I.J. Dexamethasone induces
limited apoptosis and extensive sublethal damage to specific subregions of the striatum and
hippocampus: implications for mood disorders // Neuroscience. 2001. V. 104. № 1. - P. 5769.
81. He J., Varma A., Weissfeld L.A., Devaskar S.U. Postnatal glucocorticoid exposure alters the
adult phenotype // Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2004. V. 287. № 1. - P. R198208.
82. Heaton M.B., Mitchell J.J., Paiva M., Walker D.W. Ethanol-induced alterations in the
expression of neurotrophic factors in the developing rat central nervous system // Brain Res
Dev Brain Res. 2000. V. 121. № 1. - P. 97-107.
83. Hengartner M.O. The biochemistry of apoptosis // Nature. 2000. V. 407. № 6805. - P. 770-6.
84. Herr I., Gassler N., Friess H., Buchler M.W. Regulation of differential pro- and antiapoptotic signaling by glucocorticoids // Apoptosis. 2007. V. 12. № 2. - P. 271-91.
87. Hofer M.M., Barde Y.A. Brain-derived neurotrophic factor prevents neuronal death in vivo
// Nature. 1988. V. 331. № 6153. - P. 261-2.
88. Horvitz H.R. Genetic control of programmed cell death in the nematode Caenorhabditis
elegans // Cancer Res. 1999. V. 59. № 7. - P. 1701-1706
89. Hossain A., Hajman K., Charitidi K., Erhardt S., Zimmermann U., Knipper M., Canlon B.
Prenatal dexamethasone impairs behavior and the activation of the BDNF exon IV promoter
in the paraventricular nucleus in adult offspring // Endocrinology. 2008. V. 149. № 12. - P.
6356-65.
119
90. Hu Z., Yuri K., Ozawa H., Lu H., Kawata M. The in vivo time course for elimination of
adrenalectomy-induced apoptotic profiles from the granule cell layer of the rat hippocampus
// J Neurosci. 1997. V. 17. № 11. - P. 3981-9.
91. Huang E.J., Reichardt L.F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction // Annu Rev
Biochem. 2003. V. 72. - P. 609-42.
92. Huang L.E., Bunn H.F. Hypoxia-inducible factor and its biomedical relevance // J Biol
Chem. 2003. V. 278. № 22. - P. 19575-8.
93. Ikonomidou C. Triggers of apoptosis in the immature brain // Brain Dev. 2009. V. 31. № 7. P. 488-92.
94. Jerome C.P., Hendrickx A.G. Ultrastructure of the rostral notochord of the 35-day rhesus
monkey (Macaca mulatta) embryo // Acta Anat (Basel). 1988. V. 132. № 1. - P. 35-40.
95. Jobe A.H., Nitsos I., Pillow J.J., Polglase G.R., Kallapur S.G., Newnham J.P.
Betamethasone dose and formulation for induced lung maturation in fetal sheep // Am J
Obstet Gynecol. 2009. V. 201. № 6. - P. 611 e1-7.
96. Johnson T.S., Rock P.B., Fulco C.S., Trad L.A., Spark R.F., Maher J.T. Prevention of acute
mountain sickness by dexamethasone // N Engl J Med. 1984. V. 310. № 11. - P. 683-6.
97. Kanagawa T., Tomimatsu T., Hayashi S., Shioji M., Fukuda H., Shimoya K., Murata Y. The
effects of repeated corticosteroid administration on the neurogenesis in the neonatal rat //
Am J Obstet Gynecol. 2006. V. 194. № 1. - P. 231-8.
98. Karst H., Wadman W.J., Joels M. Corticosteroid receptor-dependent modulation of calcium
currents in rat hippocampal CA1 neurons // Brain Res. 1994. V. 649. № 1-2. - P. 234-42.
99. Katoh-Semba R., Takeuchi I.K., Semba R., Kato K. Distribution of brain-derived
neurotrophic factor in rats and its changes with development in the brain // J Neurochem.
1997. V. 69. № 1. - P. 34-42.
100. Kerr J.F., Wyllie A.H., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wideranging implications in tissue kinetics // Br J Cancer. 1972. V. 26. № 4. - P. 239-57.
101. Kim W.R., Sun W. Programmed cell death during postnatal development of the rodent
nervous system // Dev Growth Differ. 2011. V. 53. № 2. - P. 225-35.
120
102. Kodama T., Shimizu N., Yoshikawa N., Makino Y., Ouchida R., Okamoto K., Hisada T.,
Nakamura H., Morimoto C., Tanaka H. Role of the glucocorticoid receptor for regulation of
hypoxia-dependent gene expression // J Biol Chem. 2003. V. 278. № 35. - P. 33384-91.
103. Koh S., Higgins G.A. Differential regulation of the low-affinity nerve growth factor
receptor during postnatal development of the rat brain // J Comp Neurol. 1991. V. 313. № 3.
- P. 494-508.
104. Koh S., Loy R. Localization and development of nerve growth factor-sensitive rat basal
forebrain neurons and their afferent projections to hippocampus and neocortex // J Neurosci.
1989. V. 9. № 9. - P. 2999-0318.
105. Koshimizu H., Hazama S., Hara T., Ogura A., Kojima M. Distinct signaling pathways of
precursor BDNF and mature BDNF in cultured cerebellar granule neurons // Neurosci Lett.
2010. V. 473. № 3. - P. 229-32.
106. Koshimizu H., Kiyosue K., Hara T., Hazama S., Suzuki S., Uegaki K., Nagappan G.,
Zaitsev E., Hirokawa T., Tatsu Y., Ogura A., Lu B., Kojima M. Multiple functions of
precursor BDNF to CNS neurons: negative regulation of neurite growth, spine formation and
cell survival // Mol Brain. 2009. V. 2. - P. 27.
107. Kroemer G., Martin S.J. Caspase-independent cell death // Nat Med. 2005. V. 11. № 7. - P.
725-30.
108. LaBorde J.B., Hansen D.K., Young J.F., Sheehan D.M., Holson R.R. Prenatal
dexamethasone exposure in rats: effects of dose, age at exposure, and drug-induced
hypophagia on malformations and fetal organ weights // Fundam Appl Toxicol. 1992. V. 19.
№ 4. - P. 545-54.
109. Lafleur J., Giron M., Demarco M., Kennedy R., BeLue R., Shields C. Cognitive effects of
dexamethasone at high altitude // Wilderness Environ Med. 2003. V. 14. № 1. - P. 20-3.
110. Leal T.L., Alippi R.M., Vargas M., Leon-Velarde F., Bozzini C.E. Body weight loss during
acute hypoxia: effects of increased convective oxygen transport or previous acclimation //
Acta Physiol Pharmacol Ther Latinoam. 1995. V. 45. № 1. - P. 9-14.
111. Lee Y.C., Damholt A.B., Billestrup N., Kisbye T., Galante P., Michelsen B., Kofod H.,
Nielsen J.H. Developmental expression of proprotein convertase 1/3 in the rat // Mol Cell
Endocrinol. 1999. V. 155. № 1-2. - P. 27-35.
121
112. Levi-Montalcini R., Hamburger V. Selective growth stimulating effects of mouse sarcoma on
the sensory and sympathetic nervous system of the chick embryo // J Exp Zool. 1951. V.
116. № 2. - P. 321-61.
113. Lindsay R.M. Nerve growth factors (NGF, BDNF) enhance axonal regeneration but are not
required for survival of adult sensory neurons // J Neurosci. 1988. V. 8. № 7. - P. 2394-405.
114. Low J.A., Froese A.B., Galbraith R.S., Smith J.T., Karchmar E.J. Middle cerebral artery
blood flow velocity in the newborn following delivery // Clin Invest Med. 1993. V. 16. № 1.
- P. 29-37.
115. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin
phenol reagent // J Biol Chem. 1951. V. 193. № 1. - P. 265-75.
116. Lu B., Pang P.T., Woo N.H. The yin and yang of neurotrophin action // Nat Rev Neurosci.
2005. V. 6. № 8. - P. 603-14.
117. Macaya A., Munell F., Ferrer I., de Torres C., Reventos J. Cell death and associated c-jun
induction in perinatal hypoxia-ischemia. Effect of the neuroprotective drug dexamethasone //
Brain Res Mol Brain Res. 1998. V. 56. № 1-2. - P. 29-37.
118. Mach M., Dubovicky M., Navarova J., Brucknerova I., Ujhazy E. Experimental modeling of
hypoxia in pregnancy and early postnatal life // Interdiscip Toxicol. 2009. V. 2. № 1. - P. 2832.
119. Machaalani R., Waters K.A. Increased neuronal cell death after intermittent hypercapnic
hypoxia in the developing piglet brainstem // Brain Res. 2003. V. 985. № 2. - P. 127-34.
120. Magiera M.M., Mora S., Mojsa B., Robbins I., Lassot I., Desagher S. Trim17-mediated
ubiquitination and degradation of Mcl-1 initiate apoptosis in neurons // Cell Death Differ.
2013. V. 20. № 2. - P. 281-92.
121. Maisonpierre P.C., Belluscio L., Friedman B., Alderson R.F., Wiegand S.J., Furth M.E.,
Lindsay R.M., Yancopoulos G.D. NT-3, BDNF, and NGF in the developing rat nervous
system: parallel as well as reciprocal patterns of expression // Neuron. 1990. V. 5. № 4. - P.
501-9.
122. Marshansky V., Wang X., Bertrand R., Luo H., Duguid W., Chinnadurai G., Kanaan N., Vu
M.D., Wu J. Proteasomes modulate balance among proapoptotic and antiapoptotic Bcl-2
122
family members and compromise functioning of the electron transport chain in leukemic
cells // J Immunol. 2001. V. 166. № 5. - P. 3130-42.
123. Matherne G.P., Headrick J.P., Coleman S.D., Berne R.M. Interstitial transudate purines in
normoxic and hypoxic immature and mature rabbit hearts // Pediatr Res. 1990. V. 28. № 4. P. 348-53.
124. McKay L.I., Cidlowski J.A. Molecular control of immune/inflammatory responses:
interactions between nuclear factor-kappa B and steroid receptor-signaling pathways //
Endocr Rev. 1999. V. 20. № 4. - P. 435-59.
125. McMillan T.M., Herbert C.M. Further recovery in a potential treatment withdrawal case 10
years after brain injury // Brain Inj. 2004. V. 18. № 9. - P. 935-40.
126. McTernan C.L., Draper N., Nicholson H., Chalder S.M., Driver P., Hewison M., Kilby M.D.,
Stewart P.M. Reduced placental 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 mRNA levels
in human pregnancies complicated by intrauterine growth restriction: an analysis of possible
mechanisms // J Clin Endocrinol Metab. 2001. V. 86. № 10. - P. 4979-83.
127. Meaney M.J., Sapolsky R.M., McEwen B.S. The development of the glucocorticoid receptor
system in the rat limbic brain. I. Ontogeny and autoregulation // Brain Res. 1985. V. 350. №
1-2. - P. 159-64.
128. Meier P., Finch A., Evan G. Apoptosis in development // Nature. 2000. V. 407. № 6805. - P.
796-801.
129. Meinecke D.L., Rakic P. Low-affinity p75 nerve growth factor receptor expression in the
embryonic monkey telencephalon: timing and localization in diverse cellular elements //
Neuroscience. 1993. V. 54. № 1. - P. 105-16.
130. Menshanov P.N., Bannova A.V., Dygalo N.N. Region-specific interrelations between
apoptotic proteins expression and DNA fragmentation in the neonatal rat brain // Neurochem
Res. 2006. V. 31. № 7. - P. 869-75.
131. Merino R., Ding L., Veis D.J., Korsmeyer S.J., Nunez G. Developmental regulation of the
Bcl-2 protein and susceptibility to cell death in B lymphocytes // EMBO J. 1994. V. 13. №
3. - P. 683-91.
123
132. Merlio J.P., Ernfors P., Jaber M., Persson H. Molecular cloning of rat trkC and distribution
of cells expressing messenger RNAs for members of the trk family in the rat central nervous
system // Neuroscience. 1992. V. 51. № 3. - P. 513-32.
133. Merry D.E., Korsmeyer S.J. Bcl-2 gene family in the nervous system // Annu Rev Neurosci.
1997. V. 20. - P. 245-67.
134. Miklos I.H., Kovacs K.J. GABAergic innervation of corticotropin-releasing hormone (CRH)secreting parvocellular neurons and its plasticity as demonstrated by quantitative
immunoelectron microscopy // Neuroscience. 2002. V. 113. № 3. - P. 581-92.
135. Moisan M.P., Seckl J.R., Edwards C.R. 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase bioactivity
and messenger RNA expression in rat forebrain: localization in hypothalamus, hippocampus,
and cortex // Endocrinology. 1990. V. 127. № 3. - P. 1450-5.
136. Montaron M.F., Petry K.G., Rodriguez J.J., Marinelli M., Aurousseau C., Rougon G., Le
Moal M., Abrous D.N. Adrenalectomy increases neurogenesis but not PSA-NCAM
expression in aged dentate gyrus // Eur J Neurosci. 1999. V. 11. № 4. - P. 1479-85.
137. Morrison G., Fraser D.D., Cepinskas G. Mechanisms and consequences of acquired brain
injury during development // Pathophysiology. 2013. V. 20. № 1. - P. 49-57.
138. Mortola J.P., Xu L.J., Lauzon A.M. Body growth, lung and heart weight, and DNA content
in newborn rats exposed to different levels of chronic hypoxia // Can J Physiol Pharmacol.
1990. V. 68. № 12. - P. 1590-4.
139. Mowla S.J., Pareek S., Farhadi H.F., Petrecca K., Fawcett J.P., Seidah N.G., Morris S.J.,
Sossin W.S., Murphy R.A. Differential sorting of nerve growth factor and brain-derived
neurotrophic factor in hippocampal neurons // J Neurosci. 1999. V. 19. № 6. - P. 2069-80.
140. Mulholland P.J., Self R.L., Harris B.R., Littleton J.M., Prendergast M.A. (-)-nicotine
ameliorates corticosterone's potentiation of N-methyl-d-aspartate receptor-mediated cornu
ammonis 1 toxicity // Neuroscience. 2004. V. 125. № 3. - P. 671-82.
141. Nair S.M., Karst H., Dumas T., Phillips R., Sapolsky R.M., Rumpff-van Essen L., Maslam
S., Lucassen P.J., Joels M. Gene expression profiles associated with survival of individual
rat dentate cells after endogenous corticosteroid deprivation // Eur J Neurosci. 2004. V. 20.
№ 12. - P. 3233-43.
124
142. Nakajima W., Ishida A., Lange M.S., Gabrielson K.L., Wilson M.A., Martin L.J., Blue M.E.,
Johnston M.V. Apoptosis has a prolonged role in the neurodegeneration after hypoxic
ischemia in the newborn rat // J Neurosci. 2000. V. 20. № 21. - P. 7994-8004.
143. Natsume N., Narukawa T., Kawai T. Teratogenesis of dexamethasone and preventive effect
of vitamin B12 // Int J Oral Maxillofac Surg. 1986. V. 15. № 6. - P. 752-5.
144. Naumenko E.V., Dygalo N.N. Noradrenergic brain mechanisms and emotional stress in adult
rats after prenatal hydrocortisone treatment // Biogenic Amines in Development,
Elsevier/North Holland Biomedical Press. 1980. Р. 373-388.
145. Nechushtan A., Smith C.L., Hsu Y.T., Youle R.J. Conformation of the Bax C-terminus
regulates subcellular location and cell death // EMBO J. 1999. V. 18. № 9. - P. 2330-41.
146. Nicholas A., Munhoz C.D., Ferguson D., Campbell L., Sapolsky R. Enhancing cognition
after stress with gene therapy // J Neurosci. 2006. V. 26. № 45. - P. 11637-43.
147. Nijboer C.H., Heijnen C.J., Groenendaal F., May M.J., van Bel F., Kavelaars A. A dual role
of the NF-kappaB pathway in neonatal hypoxic-ischemic brain damage // Stroke. 2008. V.
39. № 9. - P. 2578-86.
148. Nitta A., Ohmiya M., Sometani A., Itoh M., Nomoto H., Furukawa Y., Furukawa S. Brainderived neurotrophic factor prevents neuronal cell death induced by corticosterone // J
Neurosci Res. 1999. V. 57. № 2. - P. 227-35.
149. Niture S.K., Jaiswal A.K. Inhibitor of Nrf2 (INrf2 or Keap1) protein degrades Bcl-xL via
phosphoglycerate mutase 5 and controls cellular apoptosis // J Biol Chem. 2011. V. 286. №
52. - P. 44542-56.
150. Numakawa T., Kumamaru E., Adachi N., Yagasaki Y., Izumi A., Kunugi H. Glucocorticoid
receptor interaction with TrkB promotes BDNF-triggered PLC-gamma signaling for
glutamate release via a glutamate transporter // Proc Natl Acad Sci U S A. 2009. V. 106. №
2. - P. 647-52.
151. Nunez G., Benedict M.A., Hu Y., Inohara N. Caspases: the proteases of the apoptotic
pathway // Oncogene. 1998. V. 17. № 25. - P. 3237-45.
152. Nyakas C., Buwalda B., Luiten P.G. Hypoxia and brain development // Prog Neurobiol.
1996. V. 49. № 1. - P. 1-51.
125
153. Oppenheim R.W. Cell death during development of the nervous system // Annu Rev
Neurosci. 1991. V. 14. - P. 453-501.
154. Packan D.R., Sapolsky R.M. Glucocorticoid endangerment of the hippocampus: tissue,
steroid and receptor specificity // Neuroendocrinology. 1990. V. 51. № 6. - P. 613-8.
155. Parsadanian A.S., Cheng Y., Keller-Peck C.R., Holtzman D.M., Snider W.D. Bcl-xL is an
antiapoptotic regulator for postnatal CNS neurons // J Neurosci. 1998. V. 18. № 3. - P. 100919.
156. Pascual-Le Tallec L., Lombes M. The mineralocorticoid receptor: a journey exploring its
diversity and specificity of action // Mol Endocrinol. 2005. V. 19. № 9. - P. 2211-21.
157. Patel P.D., Sherman T.G., Goldman D.J., Watson S.J. Molecular cloning of a
mineralocorticoid (type I) receptor complementary DNA from rat hippocampus // Mol
Endocrinol. 1989. V. 3. № 11. - P. 1877-85.
158. Peng J.H., Feng Y., Rhodes P.G. Down-regulation of phospholipase D2 mRNA in neonatal
rat brainstem and cerebellum after hypoxia-ischemia // Neurochem Res. 2006. V. 31. № 10.
- P. 1191-6.
159. Petrella A., Ercolino S.F., Festa M., Gentilella A., Tosco A., Conzen S.D., Parente L.
Dexamethasone inhibits TRAIL-induced apoptosis of thyroid cancer cells via Bcl-xL
induction // Eur J Cancer. 2006. V. 42. № 18. - P. 3287-93.
160. Purves D., Snider W.D., Voyvodic J.T. Trophic regulation of nerve cell morphology and
innervation in the autonomic nervous system // Nature. 1988. V. 336. № 6195. - P. 123-8.
161. Qiu J., Grafe M.R., Schmura S.M., Glasgow J.N., Kent T.A., Rassin D.K., Perez-Polo J.R.
Differential NF-kappa B regulation of bcl-x gene expression in hippocampus and basal
forebrain in response to hypoxia // J Neurosci Res. 2001. V. 64. № 3. - P. 223-34.
162. Radka S.F., Holst P.A., Fritsche M., Altar C.A. Presence of brain-derived neurotrophic factor
in brain and human and rat but not mouse serum detected by a sensitive and specific
immunoassay // Brain Res. 1996. V. 709. № 1. - P. 122-301.
163. Renton J.P., Xu N., Clark J.J., Hansen M.R. Interaction of neurotrophin signaling with Bcl-2
localized to the mitochondria and endoplasmic reticulum on spiral ganglion neuron survival
and neurite growth // J Neurosci Res. 2010. V. 88. № 10. - P. 2239-51.
126
164. Reul J.M., de Kloet E.R. Two receptor systems for corticosterone in rat brain:
microdistribution and differential occupation // Endocrinology. 1985. V. 117. № 6. - P.
2505-11.
165. Roberts A.D., Moore C.F., DeJesus O.T., Barnhart T.E., Larson J.A., Mukherjee J., Nickles
R.J., Schueller M.J., Shelton S.E., Schneider M.L. Prenatal stress, moderate fetal alcohol,
and dopamine system function in rhesus monkeys // Neurotoxicol Teratol. 2004. V. 26. № 2.
- P. 169-78.
166. Robertson D.E., Farid R.S., Moser C.C., Urbauer J.L., Mulholland S.E., Pidikiti R., Lear
J.D., Wand A.J., DeGrado W.F., Dutton P.L. Design and synthesis of multi-haem proteins //
Nature. 1994. V. 368. № 6470. - P. 425-32.
167. Robinson M.J., Cobb M.H. Mitogen-activated protein kinase pathways // Curr Opin Cell
Biol. 1997. V. 9. № 2. - P. 180-6.
168. Rocamora N., Garcia-Ladona F.J., Palacios J.M., Mengod G. Differential expression of
brain-derived neurotrophic factor, neurotrophin-3, and low-affinity nerve growth factor
receptor during the postnatal development of the rat cerebellar system // Brain Res Mol
Brain Res. 1993. V. 17. № 1-2. - P. 1-8.
169. Rogalska J., Kang P., Wotherspoon W., Macleod M.R., Lai M. Effect of hyperthermia and
anoxia on glucocorticoid and mineralocorticoid receptor expression in neonatal rat
hippocampus // Neurosci Lett. 2009. V. 450. № 2. - P. 196-200.
170. Roset R., Ortet L., Gil-Gomez G. Role of Bcl-2 family members on apoptosis: what we have
learned from knock-out mice // Front Biosci. 2007. V. 12. - P. 4722-30.
171. Roskoden T., Otten U., Schwegler H. Early postnatal corticosterone administration regulates
neurotrophins and their receptors in septum and hippocampus of the rat // Exp Brain Res.
2004. V. 154. № 2. - P. 183-91.
172. Roth K.A., D'Sa C. Apoptosis and brain development // Ment Retard Dev Disabil Res Rev.
2001. V. 7. № 4. - P. 261-6.
173. Roy M., Sapolsky R.M. The exacerbation of hippocampal excitotoxicity by glucocorticoids
is not mediated by apoptosis // Neuroendocrinology. 2003. V. 77. № 1. - P. 24-31.
127
174. Sabbah M., Kang K.I., Tora L., Redeuilh G. Oestrogen receptor facilitates the formation of
preinitiation complex assembly: involvement of the general transcription factor TFIIB //
Biochem J. 1998. V. 336 ( Pt 3). - P. 639-46.
175. Sadowski H.B., Shuai K., Darnell J.E., Jr., Gilman M.Z. A common nuclear signal
transduction pathway activated by growth factor and cytokine receptors // Science. 1993. V.
261. № 5129. - P. 1739-44.
176. Sandau U.S., Handa R.J. Glucocorticoids exacerbate hypoxia-induced expression of the proapoptotic gene Bnip3 in the developing cortex // Neuroscience. 2007. V. 144. № 2. - P. 48294.
177. Sandeep T.C., Walker B.R. Pathophysiology of modulation of local glucocorticoid levels by
11beta-hydroxysteroid dehydrogenases // Trends Endocrinol Metab. 2001. V. 12. № 10. - P.
446-53.
178. Sapolsky R.M., Meaney M.J. Maturation of the adrenocortical stress response:
neuroendocrine control mechanisms and the stress hyporesponsive period // Brain Res. 1986.
V. 396. № 1. - P. 64-76.
179. Sapolsky R.M., Romero L.M., Munck A.U. How do glucocorticoids influence stress
responses? Integrating permissive, suppressive, stimulatory, and preparative actions //
Endocr Rev. 2000. V. 21. № 1. - P. 55-89.
180. Sapolsky R.M. Stress and plasticity in the limbic system // Neurochem Res. 2003. V. 28. №
11. - P. 1735-42.
181. Sarabdjitsingh R.A., Meijer O.C., Schaaf M.J., de Kloet E.R. Subregion-specific differences
in translocation patterns of mineralocorticoid and glucocorticoid receptors in rat
hippocampus // Brain Res. 2009. V. 1249. - P. 43-53.
182. Sauerbier I. Circadian modification of ethanol damage in utero to mice // Am J Anat. 1987.
V. 178. № 2. - P. 170-4.
183. Schaaf M.J., de Jong J., de Kloet E.R., Vreugdenhil E. Downregulation of BDNF mRNA and
protein in the rat hippocampus by corticosterone // Brain Res. 1998. V. 813. № 1. - P. 11220.
128
184. Schaaf M.J., Sibug R.M., Duurland R., Fluttert M.F., Oitzl M.S., De Kloet E.R., Vreugdenhil
E. Corticosterone effects on BDNF mRNA expression in the rat hippocampus during morris
water maze training // Stress. 1999. V. 3. № 2. - P. 173-83.
185. Schorr K., Furth P.A. Induction of bcl-xL expression in mammary epithelial cells is
glucocorticoid-dependent but not signal transducer and activator of transcription 5dependent // Cancer Res. 2000. V. 60. № 21. - P. 5950-3.
186. Schwartz P.M., Borghesani P.R., Levy R.L., Pomeroy S.L., Segal R.A. Abnormal cerebellar
development and foliation in BDNF-/- mice reveals a role for neurotrophins in CNS
patterning // Neuron. 1997. V. 19. № 2. - P. 269-81.
187. Schwartzman R.A., Cidlowski J.A. Apoptosis: the biochemistry and molecular biology of
programmed cell death // Endocr Rev. 1993. V. 14. № 2. - P. 133-51.
188. Seckl J.R., Walker B.R. 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 as a modulator of
glucocorticoid action: from metabolism to memory // Trends Endocrinol Metab. 2004. V.
15. № 9. - P. 418-24.
189. Shi S.S., Shao S.H., Yuan B.P., Pan F., Li Z.L. Acute stress and chronic stress change brainderived neurotrophic factor (BDNF) and tyrosine kinase-coupled receptor (TrkB) expression
in both young and aged rat hippocampus // Yonsei Med J. 2010. V. 51. № 5. - P. 661-71.
190. Shi Y. Mechanisms of caspase activation and inhibition during apoptosis // Mol Cell. 2002.
V. 9. № 3. - P. 459-70.
191. Sionov R.V., Cohen O., Kfir S., Zilberman Y., Yefenof E. Role of mitochondrial
glucocorticoid receptor in glucocorticoid-induced apoptosis // J Exp Med. 2006a. V. 203. №
1. - P. 189-201.
192. Sionov R.V., Kfir S., Zafrir E., Cohen O., Zilberman Y., Yefenof E. Glucocorticoid-induced
apoptosis revisited: a novel role for glucocorticoid receptor translocation to the mitochondria
// Cell Cycle. 2006b. V. 5. № 10. - P. 1017-26.
193. Soga T., Dalpatadu S.L., Wong D.W., Parhar I.S. Neonatal dexamethasone exposure downregulates GnRH expression through the GnIH pathway in female mice // Neuroscience.
2012. V. 218. - P. 56-64.
194. Speirs H.J., Seckl J.R., Brown R.W. Ontogeny of glucocorticoid receptor and 11betahydroxysteroid dehydrogenase type-1 gene expression identifies potential critical periods of
129
glucocorticoid susceptibility during development // J Endocrinol. 2004. V. 181. № 1. - P.
105-16.
195. Stein-Behrens B.A., Lin W.J., Sapolsky R.M. Physiological elevations of glucocorticoids
potentiate glutamate accumulation in the hippocampus // J Neurochem. 1994. V. 63. № 2. P. 596-602.
196. Sun L., Trausch-Azar J.S., Ciechanover A., Schwartz A.L. E2A protein degradation by the
ubiquitin-proteasome system is stage-dependent during muscle differentiation // Oncogene.
2007. V. 26. № 3. - P. 441-8.
197. Takahashi K., Saitoh A., Yamada M., Iwai T., Inagaki M. Dexamethasone indirectly induces
Ndrg2 expression in rat astrocytes // J Neurosci Res. 2012. V. 90. № 1. - P. 160-6.
198. Taoufik E., Probert L. Ischemic neuronal damage // Curr Pharm Des. 2008. V. 14. № 33. - P.
3565-73.
199. Thornberry N.A. Caspases: a decade of death research // Cell Death Differ. 1999. V. 6. №
11. - P. 1023-7.
200. Thornton C., Rousset C.I., Kichev A., Miyakuni Y., Vontell R., Baburamani A.A., Fleiss B.,
Gressens P., Hagberg H. Molecular mechanisms of neonatal brain injury // Neurol Res Int.
2012. V. 2012. - P. 506-20.
201. Tomimatsu T., Fukuda H., Endoh M., Mu J., Watanabe N., Kohzuki M., Fujii E., Kanzaki T.,
Oshima K., Doi K., Kubo T., Murata Y. Effects of neonatal hypoxic-ischemic brain injury
on skilled motor tasks and brainstem function in adult rats // Brain Res. 2002. V. 926. № 12. - P. 108-17.
202. Troy C.M., Akpan N., Jean Y.Y. Regulation of caspases in the nervous system implications
for functions in health and disease // Prog Mol Biol Transl Sci. 2011. V. 99. - P. 265-305.
203. Tuor U.I., Simone C.S., Arellano R., Tanswell K., Post M. Glucocorticoid prevention of
neonatal hypoxic-ischemic damage: role of hyperglycemia and antioxidant enzymes // Brain
Res. 1993. V. 604. № 1-2. - P. 165-72.
204. Tuor U.I., Yager J.Y., Bascaramurty S., Del Bigio M.R. Dexamethasone prevents
hypoxia/ischemia-induced reductions in cerebral glucose utilization and high-energy
phosphate metabolites in immature brain // J Neurochem. 1997. V. 69. № 5. - P. 1954-63.
130
205. Uno H., Lohmiller L., Thieme C., Kemnitz J.W., Engle M.J., Roecker E.B., Farrell P.M.
Brain damage induced by prenatal exposure to dexamethasone in fetal rhesus macaques. I.
Hippocampus // Brain Res Dev Brain Res. 1990. V. 53. № 2. - P. 157-67.
206. van Delft M.F., Huang D.C. How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis //
Cell Res. 2006. V. 16. № 2. - P. 203-13.
207. van der Laan S., Meijer O.C. Pharmacology of glucocorticoids: beyond receptors // Eur J
Pharmacol. 2008. V. 585. № 2-3. - P. 483-91.
208. Vekrellis K., McCarthy M.J., Watson A., Whitfield J., Rubin L.L., Ham J. Bax promotes
neuronal cell death and is downregulated during the development of the nervous system //
Development. 1997. V. 124. № 6. - P. 1239-49.
209. Viegas L.R., Vicent G.P., Baranao J.L., Beato M., Pecci A. Steroid hormones induce bcl-X
gene expression through direct activation of distal promoter P4 // J Biol Chem. 2004. V. 279.
№ 11. - P. 9831-9.
210. Vlodavsky E., Palzur E., Feinsod M., Soustiel J.F. Evaluation of the apoptosis-related
proteins of the BCL-2 family in the traumatic penumbra area of the rat model of cerebral
contusion, treated by hyperbaric oxygen therapy: a quantitative immunohistochemical study
// Acta Neuropathol. 2005. V. 110. № 2. - P. 120-6.
211. Wagner A.E., Huck G., Stiehl D.P., Jelkmann W., Hellwig-Burgel T. Dexamethasone
impairs hypoxia-inducible factor-1 function // Biochem Biophys Res Commun. 2008. V.
372. № 2. - P. 336-40.
212. Walker C.D., Perrin M., Vale W., Rivier C. Ontogeny of the stress response in the rat: role of
the pituitary and the hypothalamus // Endocrinology. 1986. V. 118. № 4. - P. 1445-51.
213. Wang X., Pongrac J.L., DeFranco D.B. Glucocorticoid receptors in hippocampal neurons
that do not engage proteasomes escape from hormone-dependent down-regulation but
maintain transactivation activity // Mol Endocrinol. 2002. V. 16. № 9. - P. 1987-98.
214. Weinstein R.S., Nicholas R.W., Manolagas S.C. Apoptosis of osteocytes in glucocorticoidinduced osteonecrosis of the hip // J Clin Endocrinol Metab. 2000. V. 85. № 8. - P. 2907-12.
215. White L.D., Barone S., Jr. Qualitative and quantitative estimates of apoptosis from birth to
senescence in the rat brain // Cell Death Differ. 2001. V. 8. № 4. - P. 345-56.
131
216. White P.C., Mune T., Agarwal A.K. 11 beta-Hydroxysteroid dehydrogenase and the
syndrome of apparent mineralocorticoid excess // Endocr Rev. 1997. V. 18. № 1. - P. 13556.
217. Whitelaw A., Thoresen M. Antenatal steroids and the developing brain // Arch Dis Child
Fetal Neonatal Ed. 2000. V. 83. № 2. - P. F154-7.
218. Willnow T.E., Petersen C.M., Nykjaer A. VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal
viability and function // Nat Rev Neurosci. 2008. V. 9. № 12. - P. 899-909.
219. Woolley C.S., Gould E., Sakai R.R., Spencer R.L., McEwen B.S. Effects of aldosterone or
RU28362 treatment on adrenalectomy-induced cell death in the dentate gyrus of the adult rat
// Brain Res. 1991. V. 554. № 1-2. - P. 312-5.
220. Xu H., Lu A., Sharp F.R. Regional genome transcriptional response of adult mouse brain to
hypoxia // BMC Genomics. 2011. V. 12. - P. 499.
221. Yan Q., Radeke M.J., Matheson C.R., Talvenheimo J., Welcher A.A., Feinstein S.C.
Immunocytochemical localization of TrkB in the central nervous system of the adult rat // J
Comp Neurol. 1997. V. 378. № 1. - P. 135-57.
222. Yi S.J., Masters J.N., Baram T.Z. Glucocorticoid receptor mRNA ontogeny in the fetal and
postnatal rat forebrain // Mol Cell Neurosci. 1994. V. 5. № 5. - P. 385-93.
223. Yuan J., Yankner B.A. Apoptosis in the nervous system // Nature. 2000. V. 407. № 6805. P. 802-9.
224. Zhou J., Cidlowski J.A. The human glucocorticoid receptor: one gene, multiple proteins and
diverse responses // Steroids. 2005. V. 70. № 5-7. - P. 407-17.
225. Zhou J., Pliego-Rivero B., Bradford H.F., Stern G.M. The BDNF content of postnatal and
adult rat brain: the effects of 6-hydroxydopamine lesions in adult brain // Brain Res Dev
Brain Res. 1996. V. 97. № 2. - P. 297-303.
226. Zuloaga D.G., Carbone D.L., Handa R.J. Prenatal dexamethasone selectively decreases
calretinin expression in the adult female lateral amygdala // Neurosci Lett. 2012a. V. 521. №
2. - P. 109-14.
227. Zuloaga D.G., Carbone D.L., Quihuis A., Hiroi R., Chong D.L., Handa R.J. Perinatal
dexamethasone-induced alterations in apoptosis within the hippocampus and paraventricular
nucleus of the hypothalamus are influenced by age and sex // J Neurosci Res. 2012b. V. 90.
№ 7. - P. 1403-12.