Содержание работы - Саратовский государственный университет

На правах рукописи
Мысник Леонид Владимирович
ЭКОЛОГО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ НИТРИЛА
АКРИЛОВОЙ КИСЛОТЫ НА ИММУННУЮ СИСТЕМУ ЖИВОТНЫХ
03.00.16 – экология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Саратов – 2008
Работа выполнена на кафедре технологий уничтожения химического оружия и
токсичных веществ Саратовского военного института биологической и
химической безопасности
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор,
Заслуженный деятель науки РФ
Шляхтин Геннадий Викторович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Тихомирова Елена Ивановна
доктор биологических наук, профессор
Игнатов Олег Владимирович
Ведущая организация:
Саратовский государственный медицинский
университет
Защита состоится «2» июля 2008 г. в 13 часов на заседании диссертационного
совета Д 212.243.13 при Государственном образовательном учреждении
высшего профессионального образования «Саратовский государственный
университет им. Н. Г. Чернышевского» по адресу: 410012, г. Саратов,
ул. Астраханская, д. 83. E-mail: biosovet@sgu.ru
С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке ГОУ
ВПО «Саратовский ГУ».
Автореферат разослан « 30 » мая 2008 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
С.А. Невский
2
Общая характеристика работы
Актуальность исследования. Важной и актуальной проблемой общей и
факториальной экологии является изучение действия веществ антропогенного
(техногенного) происхождения на биологические системы различных уровней
организации – молекулярные, субклеточные, клеточные, системные, органные и
организменные. К числу таких веществ относится нитрил акриловой кислоты
(НАК, акрилонитрил), который используется как сырье для производства
полиакриловых и модакриловых нитей, синтетических каучуков, нитриловых
эластиков, акриламида, клея, оргстекла и других материалов, а также
применяется в синтезе ароматических веществ. На Конференции ООН по
окружающей среде и развитию (Рио-де-Жанейро, 1992) акрилаты, в частности,
НАК включены в перечень приоритетных химических загрязнителей
(Курляндский и др., 2005). Данные литературы свидетельствуют о том, что в
последнее время загрязнение окружающей среды токсикантами общеядовитого
действия, в частности, НАК, существенно увеличилось. Это обусловлено
постоянно
растущим
широким
использованием
акрилонитрила
в
промышленности (Саватеев, Куценко, 1982, 1993; Забродский, 1993, 2002;
Германчук, 2000; Tarskikh, 2006).
Наиболее чувствительной к действию экотоксикантов является иммунная
система человека и животных, изменения в функционировании которой
предваряют различные патологические состояния (Сиротинин, 1979; Петров и
др., 1987; Хаитов и др., 1995; Ройт и др., 2000). При этом ответные реакции
организма достаточно информативно могут характеризовать специфику
воздействия экотоксикантов и могут быть использованы для оценки
экологического риска ксенобиотиков, в том числе НАК. Высокая
чувствительность факторов неспецифической резистентности организма и
системы адаптивного иммунитета к действию токсикантов позволяет оценить
нарушения иммунного гомеостаза после действия акрилонитрила в условиях
экологического неблагополучия (Сидорин и др., 1996; Забродский, 1993, 2002;
Descotes, 1986; Kimber, 1996; Friedman et al., 2003). Загрязнение окружающей
среды НАК, как и другими веществами общеядовитого действия, может вызвать
формирование вторичных иммунодефицитных состояний и развитие
обусловленных ими различных заболеваний (Шубик 1976; Хаитов и др., 1995;
Забродский, 1998; Descotes, 1986; Luster et al., 1987).
Однако на настоящий момент особенности действия НАК на
неспецифическую резистентность организма и систему адаптивного иммунитета
3
животных изучены недостаточно. В этой связи представляется актуальным
исследование нарушений иммунного гомеостаза организма животных на фоне
экологического действия акрилонитрила.
Цель исследования. Эколого-токсикологическое исследование острого,
подострого и хронического воздействия нитрила акриловой кислоты на
активность факторов естественной резистентности и механизмы адаптивного
иммунитета в организме экспериментальных животных.
Задачи исследования.
1. Определить действие НАК на интегральное состояние неспецифической
и иммунологической резистентности организма и показатели неспецифической
защиты организма.
2. Изучить влияние интоксикации НАК на содержание лимфоцитов в
органах иммунной системы экспериментальных животных.
3. Исследовать изменения гуморального звена иммунного ответа при
остром, подостром и хроническом действии НАК.
4. Оценить клеточные иммунные реакции после острого, подострого и
хронического действия НАК.
5. Определить влияние НАК на формирование вторичного
иммунодефицитного состояния по активности миграции стволовых
кроветворных клеток из костного мозга в селезенку, участию макрофагов в
индукции гуморального иммунного ответа, кооперации Т- и В-лимфоцитов,
содержанию Th1- и Th2-лимфоцитов и активности эстераз Т-клеток.
6. Изучить нарушения функции коры надпочечников и состояние
перекисного окисления липидов в клетках органов иммунной системы на фоне
действия НАК.
Научная новизна. Впервые дана комплексная эколого-токсикологическая
оценка действия НАК на активность факторов естественной резистентности и
механизмов
формирования
адаптивного
иммунитета
у
животных.
Экспериментально установлено, что острое действие в дозе 0.75 LD50, подострое
действие акрилонитрила в течение 6 сут в дозе 1/7 LD50, а также хроническая
интоксикация НАК в течение 30 и 60 сут (в дозах соответственно 0.01 и 0.005
LD50) приводит к супрессии факторов неспецифической защиты и интегрального
состояния резистентности организма. Установлено, что острое отравление
акрилонитрилом вызывает дозозависимое снижение лизоцима сыворотки крови,
фагоцитарно-метаболической
активности
нейтрофилов,
уменьшение
лимфоидного индекса тимуса и селезенки и содержания лимфоцитов в органах
системы иммунитета.
4
Впервые на клеточном и системном уровне показано снижение функций
гуморального иммунитета под влиянием острой, подострой и хронической
интоксикации НАК: уменьшение числа антителообразующих клеток в селезенке,
содержания IgМ и IgG в сыворотке крови экспериментальных животных и
супрессию функции Th2-лимфоцитов в большей степени по сравнению с
иммунным ответом, связанным с функцией Th1-лимфоцитов. Воздействие
акрилонитрила вызывает также торможение миграции стволовых кроветворных
клеток костного мозга и способности макрофагов индуцировать гуморальный
иммунный ответ. Впервые установлено, что НАК вызывает снижение
активности ацетилхолинэстеразы Т-лимфоцитов, дозозависимое уменьшение
числа эстеразопозитивных клеток в селезенке и концентрации кортикостерона в
плазме крови животных, инициацию перекисного окисления липидов.
Полученные экспериментальные данные позволяют считать, что при
остром, подостром и хроническом действии акрилонитрила в организме
животных формируется комбинированное вторичное иммунодефицитное
состояние, характеризующееся одновременным снижением функционирования
клеточного и гуморального звеньев адаптивного иммунитета.
Научно-практическая значимость. Установлены наиболее информативные
показатели иммуносупрессивного действия НАК: снижение содержания
лимфоцитов в тимусе и селезенке, активности естественных клеток-киллеров,
Т-зависимого гуморального иммунного ответа в продуктивной фазе
антителогенеза, функции Тh2-клеток в индукции синтеза IgG. Эти тесты могут
быть использованы для оценки иммунотоксичности нитрилов и других
соединений общетоксического действия. Для исследования хронического
эффекта действия НАК могут быть использованы показатели иммунных
реакций, полученных при остром отравлении ядом в дозах 0.5 и 0.75 LD50.
Материалы диссертации внедрены в учебный процесс кафедры
технологий уничтожения химического оружия и токсичных веществ
Саратовского военного института биологической и химической безопасности,
кафедры токсикологии и медицинской защиты ГОУ ВПО «Саратовский военномедицинский институт», кафедры морфологии и экологии животных ГОУ ВПО
«Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского».
Материалы диссертационной работы использованы в плановых НИР
Саратовского военного института биологической и химической безопасности, а
также в монографии «Иммунотоксикология ксенобиотиков» (Саратов. СВИБХБ,
2007).
Апробация работы. Результаты исследований были доложены на: XII
5
Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации
(Патайя, Таиланд, 2007); Российской научной конференции «Медикобиологические проблемы токсикологии и радиологии» (Санкт-Петербург, 2008);
заседаниях секции прикладных проблем безопасности хранения и уничтожения
химического оружия Поволжского отделения АВН (2005-2008 гг.); научных
конференциях кафедры токсикологии и медицинской защиты ГОУ ВПО
«Саратовский военно-медицинский институт» (2007, 2008 гг.), кафедр охраны
окружающей среды и экологической безопасности процессов хранения и
уничтожения химического оружия и токсичных веществ и технологий
уничтожения химического оружия и токсичных веществ Саратовского военного
института биологической и химической безопасности (2002 - 2008 гг.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, 2 из которых в
изданиях перечня ВАК РФ.
Декларация личного участия автора. Автор лично участвовал в проведении
лабораторных экспериментов. Обработка полученных данных, их интерпретация и
оформление осуществлены автором самостоятельно. В совместных публикациях
вклад автора составил 50-80 %.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 140 страницах,
состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов и практических рекомендаций.
Работа иллюстрирована 38 таблицами и 14 рисунками. Библиографический
указатель включает 234 источника отечественной и зарубежной литературы.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Воздействие НАК в условиях экологического неблагополучия
сопровождается снижением активности факторов неспецифической и
иммунологической резистентности организма животных, что проявляется
увеличением их чувствительности к инфекции.
2. Интоксикация НАК приводит к супрессии гуморальных и клеточных
иммунных
реакций,
преимущественному
снижению
Т-зависимого
антителообразования по сравнению с Т-независимым, при этом поражение
лимфоцитов Th2-типа более выражено, чем Th1-клеток.
3. НАК вызывает нарушение иммунного гомеостаза в организме животных
и формирование вторичного иммунодефицитного состояния вследствие снижения миграции стволовых кроветворных клеток из костного мозга, Т- и В-клеток в органы иммунной системы, кооперации Т- и В-клеток, способности
макрофагов к индукции гуморального иммунного ответа, ингибирования эстераз
Т-лимфоцитов, активизации перекисного окисления липидов.
6
Содержание работы
Во введении обосновывается актуальность исследования, его
теоретическая и практическая значимость; сформулированы основная цель и
задачи.
Глава 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О НАРУШЕНИЯХ
ИММУННОГО СТАТУСА ПОД ВЛИЯНИЕМ ТОКСИКАНТОВ
ОБЩЕЯДОВИТОГО ДЕЙСТВИЯ (обзор литературы)
В данной главе на основании анализа отечественной и зарубежной
литературы дается токсикокинетическая и токсикодинамическая характеристика
химических соединений общеядовитого действия, в том числе и НАК.
Приводятся токсикометрические параметры акрилонитрила, особенности его
воздействия на органы, системы, ткани и клетки живых организмов.
Анализируются известные данные о нарушениях неспецифической
резистентности организма и иммунного статуса животных при воздействии
акрилонитрила. Кратко описываются клинические проявления отравлений НАК.
Указаны дозы, которые формируют зону экологического неблагополучия.
Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Перечень условных сокращений: АЗКЦ – антителозависимая клеточная
цитотоксичность; АОК - антителообразующие клетки; ГЗТ – гиперчувствительность
замедленного типа; ГГНС – гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая
система; ЕКК – естественные клетки-киллеры; КОЕ – колониеобразующие
единицы; НИРО – неспецифическая и иммунологическая резистентность
организма; НРО-неспецифическая резистентность организма; НСТ-тест –
нитросиний тетразолиевый тест; ОДЛТА - отрицательный двоичный логарифм
титра антител; ПОЛ – перекисное окисление липидов; ФМАН – фагоцитарнометаболическая активность нейтрофилов; Et50 - среднеэффективное время
жизни животных.
Исследования проводились в 2002-2008 гг. на 785 неинбредных крысах и
83 мышах обоего пола. Масса животных составляла соответственно 180–240 и
18–22 г. Эксперименты на грызунах проводили в соответствии с требованиями
Женевской конвенции «International Guiding Principles for Biomedical Research
Inroling Animals» (Geneva, 1990). В качестве вещества, моделирующего острое и
хроническое действие веществ общеядовитого действия, применяли НАК.
7
НАК вводили подкожно в дозах 0.25, 0.5 и 0.75 LD50 (LD50 НАК для мышей
и крыс составляла 38+4 и 77+6 мг/кг соответственно). Подострое действие
моделировалось введением НАК в течение 6 сут в дозе 1/7 LD50, а хроническое
― в дозе 0.01 и 0.005 LD50 в течение 30 и 60 сут соответственно.
Интегральное состояние НРО и НИРО определяли по показателям течения
экспериментальной инфекции, вызванной внутрибрюшинным введением мышам
и крысам суспензии суточной культуры Е. cоli (НРО – в дозах 1.5; 2.0 и 2.5 млрд.
микробных тел без предварительной иммунизации, НИРО – в дозах 4.0; 6.0; 9.0
млрд. микробных тел). Кроме того, моделировалась экспериментальная
пневмония путем введения крысам суспензии суточной культуры Р. vulgaris в
дозах 3.5; 5.0; 6.5 млрд. микробных тел в ткань легкого c предварительной
иммунизацией данной культурой в дозе 106 микробных тел за 4 сут до
моделирования инфекционного процесса (Забродский, 1987).
При изучении факторов доиммунной защиты организма определяли
сывороточную активность лизоцима, ФМАН общепринятыми методами (Хаитов
и др., 1995; Бухарин и др., 1998; Бровкина и др., 2004; Рыбников и др., 2004).
Действие НАК на миграцию лимфоцитов из органов иммунной системы
определяли методом Хаитова и др. (1985), а КОЕ из костного мозга в селезенку –
методом эндогенного колониеобразования (Петров, Хаитов, 1972; Till, Mc
Culloch, 1961).
Исследование показателей Т-зависимого и Т-независимого гуморального
иммунного ответа проводили через 5, 8, 14 и 20 сут после острой интоксикации
НАК после иммунизации крыс эритроцитами барана и брюшнотифозным Vi-антигеном (Vi-Ag) по ОДЛТА к эритроцитам барана и Vi-Ag, а также по числу
АОК в селезенке (Белокрылов и др., 1980; Jerne, Nordin, 1963). При подострой
интоксикации НАК иммунизацию антигенами осуществляли на 2 сут после
первого введения НАК (исследование проводили на 7 сут). При хроническом
действии НАК в течение 30 и 60 сут иммунизацию делали соответственно на 26
и 56 сут хронической интоксикации (исследование проводили на 31 и 61 сут
соответственно). При исследовании кооперации Т- и В-клеток использовались
клетки мышей в модели ex vivo (Thomas, Imamura, 1986).
Для оценки клеточного иммунного ответа определяли функцию Т- лимфоцитов по секреции ими фактора, ингибирующего миграцию лейкоцитов
(Гембицкий и др., 1987), активность Th1-лимфоцитов в реакции ГЗТ, показатель
АЗКЦ (Зимин, Ляхов, 1985), активность ЕКК (Гордиенко, 1984).
Активность ацетилхолинэстеразы в Т-лимфоцитах крыс определяли
традиционным методом (Szelenyi et al., 1982). Содержание α-нафтил-АS8
ацетатэстеразо- и α-нафтилбутиратэстеразопозитивных клеток (Т-лимфоцитов,
моноцитов и макрофагов) изучали гистохимическим методом (Хейхоу,
Кваглино, 1983), используя спленоциты. Для определения уровня эритроцитов
барана в плазме крови крыс использовали флюорометрический метод (Moor et
al., 1976). ПОЛ оценивали по активности каталазы и пероксидазы, суммарной
продукции радикалов (СПР), содержанию малонового диальдегида (МДА) в
крови (Коробейникова, 1989; Валеева и др., 2002).
Полученные данные обрабатывались с использованием общепринятых
статистических методов. Расчеты проводились на персональном компьютере с
использованием пакета программ Statgraphics.
Глава 3. ВЛИЯНИЕ ОСТРОГО ОТРАВЛЕНИЯ НИТРИЛОМ АКРИЛОВОЙ
КИСЛОТЫ НА СОСТОЯНИЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ И
ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА
НАК в дозах 0.25, 0.50 и 0.75 LD50 приводил к увеличению летальности
мышей и крыс от экспериментальной инфекции. Так, у мышей летальность по
сравнению с контролем, составляющим 50%, увеличивалась соответственно на
16.6, 29 и 35%, а у крыс, при летальности в контроле 30% (р0.05)
соответственно на 3.3, 20 и 31.1%. При введении НАК в дозах 0.25, 0.50 и 0.75
LD50 у мышей и крыс отмечалось уменьшение LD50 E.сoli и Et50 (статистически
значимое – р0.05 - при дозах 0.50 и 0.75 LD50).
При подостром и хроническом действии НАК летальность крыс
увеличивалась по сравнению с контролем соответственно на 33.7, 50.0 и 38.4%
(р<0.05); статистически значимо уменьшались LD50 E. сoli и Еt50 р<0.05).
При изучении антиинфекционной НИРО установлено, что НАК (0.75 LD50)
приводит к увеличению летальности крыс от экспериментального перитонита.
Так, по сравнению с контролем, составляющим 15.5+5.3%, после острой
интоксикации этот показатель увеличивался на 22.6% (р<0.05), при этом, LD50
E. сoli уменьшалось в 1.6 раза (р<0.05), а Еt50 – в 1.3 раза (р<0.05).
При подостром и хроническом действии НАК летальность крыс
увеличивалась по сравнению с контролем соответственно на 34.5, 24.5 и 23.3%
(р<0.05). При данных воздействиях НАК статистически значимо уменьшались
LD50 E. сoli и Еt50 (р<0.05).
Острое, подострое и хроническое действие НАК приводит к увеличению
летальности крыс от экспериментальной пневмонии, вызванной Р. vulgaris. Так,
по сравнению с контролем, составляющим 22.8+7.1%, этот показатель
9
увеличивался после острой, подострой и хронической интоксикации НАК при
экспозиции 30 и 60 сут соответственно на 34.5, 40.0, 30.0 и 33.3% (р<0.05). При
остром, подостром и хроническом отравлении НАК при экспозиции 30 и 60 сут
соответственно LD50 Р. vulgaris уменьшалась в 1.8, 2, 1.7 и 1.9 раза (р<0.05), а
Еt50 – в 1.5, 1.9, 1.5 и 1.9 раза (р<0.05).
При остром действии НАК в дозах 0.25; 0.5 и 0.75 LD50 отмечался
дозозависимый эффект: содержание лизоцима в крови снижалось
соответственно в 1.26 (р>0.05), 1.49 (р<0.05) и 1.82 (р<0.05) раза. Через 1 сут
после подострого отравления НАК параметр уменьшался – в 2 раза (р<0.05), а
после хронического воздействия – в 2.4 и 2.6 раза (р<0.05).
Под влиянием острого, подострого и хронического воздействия НАК
ФМАН существенно снижалась. Воздействие НАК приводило к значительному
уменьшению фагоцитарного показателя и фагоцитарного числа. Показатели
спонтанного и индуцированного НСТ-теста под влиянием НАК через 1 сут
снижались соответственно в 2.4 и 3.6 раза (р<0.05). Восстановление показателей
при остром действии НАК отмечалось к 12 сут.
После подострого и хронического действия НАК в дозах 0.01 и 0.005 LD50
показатели ФМАН существенно снижались по сравнению с контролем (р<0.05),
причем степень их уменьшения приблизительно соответствовала редукции
параметров после острого действия НАК в дозе 0.75 LD50 через 3 сут.
Исследование ФМАН после острого отравления НАК показало прямо связанное
с дозой снижение данного параметра через 1 сут.
Таким образом, после острого, подострого и хронического действия НАК
происходит снижение НРО и НИРО (увеличивается летальность животных от
экспериментальной инфекции, уменьшается LD50 E. сoli, Р. vulgaris и Еt50),
наблюдается супрессия доиммунных факторов защиты (снижается активность
лизоцима, дозозависимо уменьшается ФМАН).
Глава 4. ВЛИЯНИЕ НИТРИЛА АКРИЛОВОЙ КИСЛОТЫ НА
СОДЕРЖАНИЕ ЛИМФОЦИТОВ В ОРГАНАХ СИСТЕМЫ ИММУНИТЕТА
Под влиянием НАК в дозах 0.25, 0.50 и 0.75 LD50, как показали наши
исследования, дозозависимо уменьшается содержание лимфоцитов в тимусе
через 1 сут после интоксикации в 1.3, 1.7 и 1.9 раза соответственно. Аналогично
изменяется содержание лимфоцитов в селезенке, костном мозге и лимфоузлах. В
крови и лимфоидных органах через 1 и 6 сут при дозе НАК 0.75 LD50 снижалось
содержание лимфоцитов, статистически значимое в крови (через 1-4 сут),
10
тимусе (через 1-6 сут), селезенке (через 1-6 сут), костном мозге (через 1 сут) и
лимфоузлах (через 1 сут) (р<0.05). Через 9 сут отмечалось восстановление
параметров до контрольного значения.
При подостром и хроническом действии НАК отмечалось приблизительно
такое же снижение показателей, как и при действии НАК в дозе 0.75 LD50 через
1–6 сут. Это свидетельствует о выраженном лимфотоксическом действии НАК.
При исследовании цитограммы тимуса нами установлено, что под
влиянием НАК в вилочковой железе через 6 сут происходит статистически
достоверное уменьшение числа малых лимфоцитов по сравнению с контролем
(p<0.05). При этом относительное количество незрелых и зрелых нейтрофилов,
эозинофилов, моноцитов, макрофагов, ретикулярных и плазматических клеток
увеличивалось (p<0.05). После острого отравления НАК уменьшение количества
лимфоцитов в тимусе сопровождалось увеличением числа других клеток.
После воздействия НАК через 6 сут в цитограмме селезенки в целом
отмечались такие же изменения, как и в тимограмме. Значимо (p<0.05)
возрастало относительное число ретикулярных клеток. Механизмы выявленных
эффектов, видимо, такие же, как и обусловливающие изменение цитограммы
тимуса.
Таким образом, под влиянием острого действия НАК происходит
дозозависимое снижение числа лимфоцитов в органах системы иммунитета и в
крови, сопровождающееся изменением цитограммы тимуса и селезенки. При
подостром и хроническом воздействии НАК отмечается снижение числа
лимфоцитов во всех лимфоидных органах.
Глава 5. ВОЗДЕЙСТВИЕ НИТРИЛА АКРИЛОВОЙ КИСЛОТЫ НА
ГУМОРАЛЬНЫЕ ИММУННЫЕ РЕАКЦИИ
Установлено, что под влиянием острого, подострого и хронического
действия НАК в индуктивной фазе иммунного ответа (введение яда
одновременно с иммунизацией эритроцитами барана) статистически значимо
снижался ОДЛТА к эритроцитам барана через 5, 8, 16 и 20 сут после
иммунизации. Так, острая интоксикация НАК в дозах 0.25, 0.50 и 0.75 LD50
приводила к редукции ОДЛТА через 5 сут соответственно в 1.3, 1.4 и 1.6 раза
(p<0.05), а через 8 сут - в 1.2, 1.3 и 1.4 раза (p<0.05), 14 сут - в 1.2, 1.4 и 1.5 раз
(p<0.05), 20 сут - в 1.1, 1.2 и 1.3 раза (p<0.05) по сравнению с контролем
соответственно. Полученные данные свидетельствуют о том, что при остром
11
действии НАК иммуносупрессивные эффекты прямо связаны с дозой
токсиканта.
При подостром и хроническом действии НАК через 30 и 60 сут
отмечалось снижение ОДЛТА. При подостром действии НАК ОДЛТА снижался
в 1.4 раза (p<0.05), а при хроническом - в 1.7 и 1.6 раза (p<0.05). НАК при
остром воздействии дозозависимо уменьшает синтез IgM, а также продукцию
IgG до 20 сут, что свидетельствует о супрессии соответственно активности Th1и Th2-лимфоцитов.
Подострое и хроническое действие НАК сопровождалось приблизительно
таким же изменением показателей, как и при остром в дозе 0.75 LD50 через 5 сут
(на синтез IgM и функцию Th1-лимфоцитов) и 8 и 14 сут (на продукцию IgG и
функцию Th2-лимфоцитов).
Показано (табл. 1), что в селезенке число АОК к эритроцитам барана у
белых крыс через 5 сут после острой интоксикации НАК (при введении яда
одновременно с эритроцитами барана) дозозависимо снижалось. Так, при дозах
НАК, составляющих 0.25, 0.50 и 0.75 LD50, показатель уменьшался в 1.6, 2 и 3
раза (р< 0.05) соответственно. Более выраженные изменения числа АОК к
эритроцитам барана были обнаружены при введении НАК через 3 сут после
иммунизации. В продуктивной фазе антителогенеза число АОК в селезенке при
дозах НАК, составляющих 0.25, 0.50 и 0.75 LD50, снижалось соответственно в
2.3, 3 и 4.5 раза (р< 0.05).
Таблица 1
Влияние острого действия НАК на число АОК к эритроцитам барана (×103),
синтезирующим IgM, в селезенке крыс через 5 сут после иммунизации
Число АОК × 103 ±
Индуктивная фаза
Продуктивная фаза
Контроль
45.3+3.5
0.25
28.2±2.6
20.1±2.1*
0.50
22.1±2.2*
15.3±2.3*
0.75
15.3±2.7*
10.0±2.0*
Примечание: в каждой серии использовалось от 6 до 8 крыс; * - различие с контролем
достоверно – р0.05
Доза, LD50
Подострое и хроническое действие НАК в течение соответственно 30 и 60
сут характеризовалось приблизительно таким же изменением показателей, как и
острое в дозе 0.75 LD50 через 5 сут (на синтез IgM и функцию Th1-лимфоцитов).
Так, число АОК, синтезирующим IgM, к эритроцитам барана в селезенке крыс
снижалось в 2.7, 2.4 и 2.3 раза (р<0.05). Установлено, что после острого
12
отравления НАК через 8 и 14 сут происходит дозозависимое снижение синтеза
IgG, оцениваемого по числу АОК, синтезирующих иммуноглобулины данного
класса. Дозы НАК, составляющие 0.25, 0.50 и 0.75 LD50 вызывали снижение
показателя через 8 сут соответственно в 1.3, 1.6 и 2 раза (р<0.05), а через 14 сут соответственно в 1.4, 1.9 и 2.4 раза (р<0.05).
При подостром и хроническом в течение соответственно 30 и 60 сут
действии НАК продукция IgG, оцениваемая по числу АОК через 8 сут после
иммунизации, уменьшалась соответственно в 1.7, 1.5 и 1.9 раза (р<0.05), а через
14 сут - соответственно в 1.9, 2.1 и 1.8 раза (р<0.05).
Дозы НАК, составляющие 0.25, 0.50 и 0.75 LD50, вызывали снижение АОК
к Vi-Ag соответственно в 1.3, 1.8 и 2.1 раза (р 0.05). Полученные результаты
показывают, что НАК в сублетальных дозах оказывает значительно меньшее
действие на Т-независимый синтез В-клетками IgM по сравнению с
Т _зависимой антителопродукцией. При подостром и хроническом действии
НАК через 30 и 60 сут в дозах соответственно 0.01 и 0.005 LD50 отмечалось
уменьшение числа АОК к Vi-Ag соответственно в 2, 1.9 и 1.7 раза (p<0.05).
Таким образом, после действия НАК происходит преимущественно
снижение Т-зависимой антителопродукции В-клетками (синтеза IgM и IgG),
связанной с функцией Th1- и Th2-лимфоцитов, более выраженное в
продуктивной фазе антителогенеза по сравнению с индуктивным периодом.
Иными словами, происходит снижение гуморального иммунного ответа под
влиянием НАК.
Глава 6. ВЛИЯНИЕ НИТРИЛА АКРИЛОВОЙ КИСЛОТЫ НА
КЛЕТОЧНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ
Установлено, что после острой интоксикации НАК у крыс через 1 и 3 сут
дозозависимо снижается функция Т-клеток. Так, дозы НАК, составляющие 0.25,
0.50 и 0.75 LD50, уменьшали функцию Т-клеток через 1 сут соответственно на
19.0 (р>0.05), 35.4 (р0.05) и 42.9% (р0.05). Снижение показателя сохранялось
до 12 сут, причем оно было статистически значимым (р0.05) при дозе НАК,
составляющей 0.5 и 0.75 LD50 в течение 9 сут. При подостром и хроническом
действии НАК через 30 и 60 сут в дозах соответственно 0.01 и 0.005 LD50
отмечалось снижение функции Т-клеток соответственно на 26.3, 36.9 и 33.8%
(р0.05).
При острой интоксикации НАК происходит дозозависимое снижение
реакции ГЗТ, характеризующей функцию Th1-лимфоцитов соответственно в 1.6,
13
1.9 и 2.4 раза (р0.05) без переноса клеток (рис. 1) и в 1.9, 1.6 и 1.7 раза (р0.05)
соответственно при переносе клеток крысам-реципиентам. Выявленные
изменения формирования ГЗТ позволяют заключить, что НАК в дозах 0.25, 0.50
и 0.75 LD50 вызывает супрессию Th1-лимфоцитов в реализации как первичного,
так и вторичного клеточного иммунного ответа.
ЕКК, %
%
уровень ГЗТ
40
40
30
*
30
*
20
*
10
0
*
20
*
*
10
1
2
3
4
1
2
3
4
Рис.1 Влияние острой интоксикации НАК на
функцию Th1-лимфоцитов по реакции ГЗТ у
крыс.
По оси ординат – уровень реакции ГЗТ у
крыс, %. По оси абсцисс – доза LD50; 1 – контроль, 2 - 0.25 LD50, 3 - 0.50 LD50,
4 - 0.75 LD50; * - различие с контролем
достоверно - р0.05
0
1
2
3
4
1
2
3
4
Рис. 2 Влияние подострого и хронического
действия НАК на ЕКК.
По оси ординат – показатель активности
ЕКК, %. По оси абсцисс – доза LD50
экспозиция, сут; 1 – контроль; 2 - 1/7 LD50
х 6 сут; 3 - 0.01 LD50×30 сут; 4 - 0.005
LD50× 60 сут; * - различие с контролем
достоверно - р0.05.
При подостром и хроническом действии НАК через 30 и 60 сут отмечалось
снижение функции Тh1-клеток в первичном клеточном иммунном ответе
соответственно в 2.1, 2.7 и 2.2 раза (р0.05), а во вторичном - соответственно в
1.86, 1.8 и 1.9 раза (р0.05).
Острое отравление НАК в дозах 0.25, 0.50 и 0.75 LD50 приводило к прямо
связанной с дозой супрессией АЗКЦ спленоцитов соответственно в 1.5, 1.8 и 2.5
раза (р0.05), а АЗКЦ тимоцитов – в 1.5, 1.7 и 2.8 раза (р0.05). При подостром
(в течение 6 сут) и хроническом действии НАК через 30 и 60 сут в дозах
соответственно 0.01 и 0.005 LD50 отмечалось уменьшение АЗКЦ спленоцитов
соответственно в 1.9, 1.86 и 1.88 раза (р0.05), а тимоцитов - в 2.2, 1.9 и 2 раза
(р0.05) соответственно.
При исследовании влияния на ЕКК НАК нами установлено (рис. 2), что
при действии токсиканта через 1 и 9 сут происходит дозозависимое снижение
активности ЕКК. Так, дозы НАК 0.25, 0.50 и 0.75 LD50, вызывали уменьшение
активности ЕКК через 1 сут в 1.4, 1.8 и 2.5 раза (р0.05), а на 9 сут – в 1.3, 1.5 и
1.6 раз (р0.05) соответственно. На 12 сут происходило восстановление
14
активности ЕКК, однако отмечалась прямо связанная с дозой тенденция к
редукции показателя.
При подостром (в течение 6 сут) и хроническом действии НАК через 30 и
60 сут в дозах 0.01 и 0.005 LD50 отмечалась супрессия функции ЕКК
соответственно в 1.9, 2.2 и 2 раза (р0.05).
Таким образом, острое, подострое и хроническое действие НАК
сопровождается уменьшением функции Т-лимфоцитов, в частности Th1-лимфоцитов, супрессией АЗКЦ и снижением активности ЕКК.
Глава 7. МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ВТОРИЧНОГО
ИММУНОДЕФИЦИТА ПРИ ДЕЙСТВИИ НИТРИЛА АКРИЛОВОЙ КИСЛОТЫ
КОЕс, усл. ед.
Нами показано (рис. 3), что острая интоксикация НАК в дозах 0.25, 0.50 и
0.75 LD50 вызывает дозозависимое снижение числа КОЕ в селезенке
соответственно в 1.5 (р> 0.05), 2.2 (р 0.05) и 3.3 раза (р 0.05). При подостром
(в течение 6 сут) и хроническом действии НАК через 30 и 60 сут в дозах
соответственно 0.01 и 0.005 LD50 отмечалось снижение миграции СКК из
костного мозга в селезенку в 2.5, 2.1 и 2.3 раза (р0.05). Полученные данные
свидетельствуют о снижении миграции из костного мозга СКК, В-клеток и
предшественников Т-лимфоцитов (Петров и др., 1981).
После действия НАК ex vivo через 1 сут функция В-клеток в кооперации с
Т-лимфоцитами снижалась в 1.4 раза (р<0.05), а функция Т-клеток - в 2 раза
(р<0.05) по сравнению с контролем.
25
16
20
12
15
8
*
10
*
5
0
1
1
2
2
3
3
4
4
Рис. 3. Влияние НАК на число КОЕ в селезенке
мышей.
По оси ординат – число КОЕс, усл. ед. По оси
абсцисс – доза LD50; 1 – контроль, 2 - доза 0,25
LD50, 3 - доза 0,50 LD50, 4 - доза 0.75 LD50; * –
различие с контролем достоверно – р0.05
*
*
*
*
4
0
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
Рис. 4. Влияние НАК на способность
макрофагов индуцировать гуморальный
иммунный ответ у крыс (по числу АОК к ЭБ х
103 через 5 сут).
По оси ординат – значение
числа АОК к ЭБ х 103. По оси абсцисс – доза
LD50, экспозиция, сут; 1 – контроль, 2 - доза
0.75 LD50, 3 - доза 1/7 LD50 х 6 сут, 4 - доза 0.01
LD50 х 30 сут, 5 - доза 0.005 LD50 х 60 сут; * –
различие с контролем достоверно – р0.05
15
При исследовании способности макрофагов индуцировать гуморальный
иммунный ответ крыс через 1 сут нами установлено (рис. 4), что острое действие
НАК в дозе 0.75 LD50 снижает способность макрофагов к индукции
антителообразования, оцениваемой по числу АОК к эритроцитам барана в
селезенке, в 2.3 раза (p<0.05) по сравнению с контролем. При подостром (в
течение 6 сут) и хроническом действии НАК через 30 и 60 сут в дозах
соответственно 0.01 и 0.005 LD50 отмечалось снижение показателя в 1.7, 1.5 и
1.8 раза (р0.05).
Острое
отравление
НАК
вызывало
повышение
содержания
кортикостерона в крови через 1 ч в 1.58 раза (p<0.05) по сравнению с
контрольным уровнем, видимо, в результате действия адрено-кортикотропного
гормона, которое сменялось снижением его синтеза через 3 и 24 ч, вероятно, в
результате ингибирования основным метаболитом нитрилов циан-ионом
компонента а3 цитохром-с-оксидазы системы энзимов тканевого дыхания
митохондрий коры надпочечников (Dhabhar et al., 1996). Через 24 ч
концентрация кортикостерона в плазме крови при действии НАК была ниже,
чем в контроле в 1.6 раз (p<0.05). Через 3 сут острое отравление НАК
(0.75 LD50) вызывало снижение кортикостерона в крови в 2.1 раза (p<0.05) по
сравнению с контрольным уровнем, а через 6 сут его концентрация существенно
не отличалась от контрольного значения.
При подостром и хроническом действии НАК через 30 и 60 сут в дозах
соответственно 0.01 и 0.005 LD50 отмечалось уменьшение концентрации
кортикостерона соответственно в 1.8, 1.6 и 1.9 раза (p<0.05). Нами установлено,
что НАК в дозе 0.75 LD50 через 3 сут снижает активность ацетилхолинэстеразы
Т-клеток тимоцитов и спленоцитов соответственно в 1.4 и 1.5 раза (р<0.001).
При подостром (в течение 6 сут) и хроническом действии НАК через 30 и 60 сут
в дозах соответственно 0.01 и 0.005 LD50 отмечалось приблизительно такое же
снижение показателя, как и при остром через 3 сут.
При остром действии НАК в дозах 0.25 и 0.50 LD50 число клеток (в
основном Т-лимфоцитов, а также моноцитов и макрофагов), содержащих α-нафтил-АS-ацетатэстеразу в спленоцитах крыс, практически не снижалось. При
действии НАК в дозе 0,75 LD50 число исследованных клеток уменьшалось в 1.3
раза (p<0.05).
Содержание α-нафтил-бутиратэстеразопозитивных клеток селезенки при
действии НАК в дозах 0.25, 0.50 LD50 существенно не снижалось, а при дозе
0.75 LD50 - уменьшалось в 1.4 раза (p<0.05).
16
НАК при остром, подостром и хроническом действии инициирует ПОЛ.
Так, при острой интоксикации НАК активность каталазы и пероксидазы,
характеризующей антиоксидантную систему, уменьшалась соответственно на
32.1 и 37.1% (p<0.05). Концентрация основного продукта ПОЛ – МДА при
остром отравлении НАК повышалась на 22.1% (p<0.05), а СПР – на 22.8%
(p<0.05). При подостром действии НАК отмечалось снижение каталазы и
пероксидазы соответственно на 35.6 и 47.3%, при хронической интоксикации в
дозе 0.01 LD50 – соответственно на 27.6 и 27.4, а в дозе 0.005 LD50 – на 40.7 и
38.2% (p<0.05). СПР и содержание МДА при подостром и хроническом действии
НАК изменялись приблизительно так же, как и при остром отравлении НАК.
Установлена выраженная прямая (r=0.69-0.78) корреляция между
параметрами системы иммунитета и показателями антиоксидантной системы и
обратная (r= - 0.67-0.78) корреляция между параметрами системы иммунитета и
показателями ПОЛ. Установлено, что показатели, характеризующие различные
иммунные реакции и связанную с ними функцию Th1- и Th2-лимфоцитов, при
действии НАК в среднем снижались соответственно в 2 и 3.1 раза. Это
свидетельствует о том, что НАК в существенно большей степени поражает
функцию Th2-лимфоцитов по сравнению с действием яда на Th1-лимфоциты.
Полученные результаты позволяют заключить, что формирование
вторичного иммунодефицитного состояния в организме экспериментальных
животных при острой, подострой и хронической интоксикации НАК
обусловлено уменьшением миграции клеток в органы системы иммунитета из
костного мозга, снижением кооперации Т- и В-лимфоцитов, вследствие
преимущественного поражения Т-клеток, менее выраженным снижением
активности Th1-лимфоцитов по сравнению с функцией Th2-клеток,
ингибированием эстераз Т-лимфоцитов, моноцитов, макрофагов и активацией
пероксидации липидов.
ВЫВОДЫ
1. Эколого-токсикологическое воздействие нитрила акриловой кислоты
характеризуется супрессией интегрального состояния неспецифической
резистентности и адаптивного иммунитета в организме животных, снижением
активности лизоцима сыворотки крови и фагоцитарно-метаболической
активности нейтрофилов.
2. Под влиянием острого, подострого и хронического воздействия нитрила
акриловой кислоты происходит уменьшение содержания лимфоцитов в органах
17
системы иммунитета и крови, изменение цитограммы тимуса и селезенки.
3. После действия нитрила акриловой кислоты происходит
преимущественно снижение Т-зависимого антителообразования по сравнению с
Т-независимым,
индукции
синтеза
IgM
и
IgG.
Уменьшение
антителообразования, связанное с функцией Th1-лимфоцитов, более выражено в
продуктивном периоде антителогенеза по сравнению с его индуктивной фазой.
4. Действие нитрила акриловой кислоты вызывает снижение активности
Т-лимфоцитов, оцениваемой по реакции ингибирования миграции лейкоцитов,
функции Th1-лимфоцитов, антителозависимой клеточной цитотоксичности и
активности естественных клеток-киллеров.
5. Нитрил акриловой кислоты вызывает нарушение иммунного гомеостаза
и формирование вторичного иммунодефицитного состояния у животных
вследствие реализации следующих механизмов: снижения миграции стволовых
клеток из костного мозга, содержания лимфоцитов в органах системы
иммунитета, кооперации Т- и В-лимфоцитов, способности макрофагов
индуцировать гуморальный иммунный ответ, более выраженной супрессии
активности Th2-лимфоцитов по сравнению с функцией Th1-клеток.
6. На фоне действия нитрила акриловой кислоты происходит
дозозависимое ингибирование эстераз Т-лимфоцитов, моноцитов и макрофагов,
снижение концентрации кортикостерона в плазме крови, активация перекисного
окисления липидов в клетках органов иммунной системы животных.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Наиболее информативными показателями эколого-токсикологического
действия нитрила акриловой кислоты, которые могут быть использованы для
оценки иммуносупрессивных эффектов нитрилов и других соединений
общетоксического действия, являются: снижение содержания лимфоцитов в
органах системы иммунитета, способности макрофагов индуцировать
гуморальный иммунный ответ, уровень активности естественных клетоккиллеров, показатели активности Т-зависимого гуморального иммунного ответа
в продуктивной фазе антителогенеза и функции Тh2-клеток.
2. При остром отравлении нитрилом акриловой кислоты в сублетальных
дозах, подостром и хроническом воздействии в условиях экологического
неблагополучия
формируется
вторичное
постинтоксикационное
иммунодефицитное состояние, требующее проведения профилактических
мероприятий, направленных на восстановление функций системы иммунитета.
18
3. Для оценки хронического эффекта действия нитрила акриловой кислоты
в концентрациях, действующих в условиях экологического неблагополучия,
могут быть использованы показатели иммунных реакций, полученные при
остром отравлении этим ядом в дозах 0.50 - 0.75 LD50.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
* - публикации в печатных изданиях перечня ВАК РФ
1. Германчук В.Г., Забродский П.Ф., Мысник Л.В. Редукция естественных
клеток-киллеров при острой интоксикации нитрилами // Сборник научных
статей. Ч.2. Биология, экология, медицина. Саратов, Саратовский военный
институт РХБЗ, 2002. С. 81–82.
2. Германчук В.Г., Забродский П.Ф., Мысник Л.В. Механизмы иммунотоксичности нитрила акриловой кислоты // Сборник научных статей.
Саратов, Саратовский военный институт РХБЗ, 2004. С. 52–54.
3. *Забродский П.Ф., Мысник Л.В. Восстановление функции Th1- и Th2лимфоцитов полиоксидонием при интоксикации нитрилом акриловой кислоты //
Аллергология и иммунология. 2007. Том 8, № 3. С. 328.
4. *Забродский П.Ф., Мандыч В.Г., Мысник Л.В. Иммунотоксические
свойства нитрила акриловой кислоты и их связь с перекисным окислением
липидов // Вестник новых медицинских технологий. 2007. Т. XIV, № 4. С. 19–20.
5. Забродский П.Ф., Мысник Л.В. Супрессия нитрилом акриловой кислоты
показателей системы иммунитета и её связь с инициацией перекисного
окисления липидов // Саратовский военный институт РБХЗ. Деп. в ВИНИТИ
31.10.2007 г., № 1005 - В2007. 8 с.
6. Мысник Л.В., Забродский П.Ф., Шляхтин Г.В. Снижение нитрилом
акриловой кислоты доиммунных механизмов защиты организма и иммунного
статуса животных // Саратовский военный институт РБХЗ. Деп. в ВИНИТИ
31.10.2007 г., № 1006 - В2007. 8 с.
7. Мысник Л.В., Шляхтин Г.В., Забродский П.Ф. Редукция
акрилонитрилом неспецифической и иммунологической резистентности
организма // Саратовский военный институт РБХЗ. Деп. в ВИНИТИ 31.10.2007г.,
№ 1007 - В2007. 9 с.
8. Мысник Л.В., Забродский П.Ф. Нарушение доиммунных механизмов
защиты при интоксикации нитрилом акриловой кислоты // Сборник научных
работ. Саратов, Саратовский военно-медицинский институт, 2007. С. 171 – 172.
9. Мысник Л.В., Забродский П.Ф. Редукция показателей
системы
иммунитета при интоксикации нитрилом акриловой кислоты // Сборник
19
научных работ. Саратов, Саратовский военно-медицинский институт, 2007.
С. 172 - 174.
10. Забродский П.Ф., Мысник Л.В., Шляхтин Г.В., Германчук В.Г.
Нарушение доиммунного механизма защиты организма от инфекций и
иммунного статуса при действии нитрила акриловой кислоты // Сборник
научных трудов. Выпуск 9. - Саратов, СВИБХБ, 2007. С. 147–150.
11. Мысник Л.В., Забродский П.Ф. Иммунотоксичность акрилонитрила и
ее связь с инициацией перекисного окисления липидов // Сборник научных
трудов. Выпуск 9. - Саратов, СВИБХБ, 2007. С. 151–154.
12. Шляхтин Г.В., Забродский П. Ф., Мысник Л.В. Снижение функции
Th1- и Th2-лимфоцитов и продуцируемых ими цитокинов у животных при
отравлении нитрилом акриловой кислоты // Вопросы биологии, экологии, химии
и методики обучения: Сборник научных статей. Вып. 10. - Саратов, 2008. С. 86 –
89. Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского.
13. Забродский П.Ф., Мысник Л.В. Влияние острого отравления
акрилонитрилом на систему иммунитета и перекисное окисление липидов //
Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии.- СПб.: ООО
«Изд-во Фолиант», 2008. - С. 92 – 94.
Подписано в печать 04.04.2007. Формат 60 × 84 1/16.
Бумага офсетная № 1. Гарнитура Таймс. Печать офсетная.
Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 89
Отпечатано в типографии ООО «Тироль».
410005, Саратов, ул. Чернышевского, 203.
20