Автореферат диссертации (624 кбайт)
advertisement
На правах рукописи ВОРОНКОВ АНДРЕЙ ВЛАДИСЛАВОВИЧ ЭНДОТЕЛИАЛЬНАЯ ДИСФУНКЦИЯ И ПУТИ ЕЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ 14.03.06. фармакология, клиническая фармакология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук ВОЛГОГРАД 2011 Работа выполнена в Государственном общеобразовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской федерации» Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Тюренков Иван Николаевич Официальные оппоненты: ЗДН РФ, доктор медицинских наук, профессор Р.С. Мирзоян ЗДН РФ, доктор медицинских наук, профессор К.М. Резников доктор медицинских наук, профессор В.А. Косолапов Ведущая организация: «НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН» г.Санкт- Петербург Защита состоится «6» октября 2011 г. в 1100 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.008.02 при ГОУ ВПО «Волгоградский государственный Минздравсоцразвития Российской медицинский федерации» университет (Россия, 400131, Волгоградская область, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, 1). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития Российской федерации» (400131, Волгоградская область, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, 1). Автореферат разослан «_____»_______________2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук А.Р. Бабаева Актуальность темы В настоящее время считается общепризнанным, что в основе развития сердечно–сосудистой патологии различного генеза важную роль играет дисфункция эндотелия (ЭД) (Петрищев Н.Н., 2003; Ярек-Мартынова И.Р., Шестакова М.В., 2011; Ding H., 2010; Potenza M.A., 2010; Maltais S., et all., 2011). Эндотелий терапевтического рассматривается воздействия для как самостоятельная коррекции различных мишень сердечно- сосудистых заболеваний (ССЗ). Исходя из этого, актуальной проблемой экспериментальной и клинической фармакологии является поиск веществ с эндотелиопротекторным действием (ЭПД) как среди известных препаратов, так и новых соединений (Карпов Ю.А. 2010). К настоящему времени установлено ЭПД препаратов, уменьшающих влияние РААС и СНС на сердечно-сосудистую систему (иАПФ, b-блокаторы и т.д.); снижающих уровень ХСобщ, ХСЛПНП, ХСЛПОНП (особенно статины); регулирующих работу Ca2+ каналов (блокаторы Ca каналов), что очевидно связано, как с прямыми эндотелий зависимыми механизмами действия так и их опосредованным комплексным фармакологическим влиянием (Luscher T.F., Noll G., 1995; Aikawa M., 2010; Egashira K., 2010; Jorge P.A., 2010). Многие из проведенных экспериментальных и клинических исследований по изучению ЭПД сердечно-сосудистых средств достаточно противоречивы и не дают однозначного ответа по направленности и выраженности действия препаратов из этих фармакологических групп. Это обусловлено тем, что многие как экспериментальные, так и клинические исследования выполнены с использованием различных методов оценки функционального состояния эндотелия (биохимических, функциональных, инвазивных, неинвазивных и т.д.), клинические же работы, кроме этого, отличаются выбором больных, различных по возрасту, тяжести заболевания, сопутствующим патологиям, протоколам исследований. Можно предполагать, что вещества с ГАМК–ергической активностью ограничивающие симпатические влияния на сердце и сосуды, уменьшающие 3 активность РААС, обладающие при этом антиоксидантной и антигипоксантной активностью (Перфилова В.Н., 2009; Тюренков И.Н., 2008; Narahashi T., 1999; Harrison 2000), могут улучшать функцию эндотелия (Недвицкий П.И., 2000; Ishide T., 2005). Однако изучение влияния ГАМК– ергических средств на эндотелий практически не выполнялось. Учитывая важную роль в развитии ЭД оксидативного стресса, можно предположить, что и антиоксиданты также могут воздействовать на различные звенья развития ЭД: на систему синтеза и биодоступности NO, гемореологические параметры крови, липидный и углеводный обмен, воспаление, пролиферацию (Насибуллин Р.С.,2010; Yamamoto, M.2008; Schiffrin E. L., 2010; Wallace T. C., 2011). Поэтому поиск высоко активных эндотелиопротекторов среди антиоксидантов, в том числе и флавоноидов, вполне оправдан. На основании изложенного представилось целесообразным провести комплексное сравнительное изучение ЭПД средств, производных ГАМК, ряда сердечно-сосудистых лекарственных средств, обладающих антиоксидантной активностью в том числе и флавоноидов в условиях ЭД различного генеза. Целью исследования является разработка методологии поиска веществ с эндотелиопротекторным действием и проведение сравнительного изучения эндотелиотропных свойств, сердечно-сосудистых средств и веществ с различными механизмами действия. Задачи исследования 1. Провести тестирование эндотелия различных сосудистых регионов в условиях нормы и экспериментальной патологии (при недостаточности половых гормонов, экспериментальном сахарном диабете, хирургической травме). 2. Изучить ГАМК, влияние флавоноидов и сердечно-сосудистых препаратов, 4 средств, обладающих производных антиоксидантной активностью на вазодилатирующую функцию эндотелия в условиях ЭСД и НПГ. 3. Изучить влияние сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, препаратов, обладающих антиоксидантной активностью, в том числе и флавоноидов на антитромботическую функцию эндотелия, гемореологию и основные параметры гемостаза в условиях ЭСД и НПГ. 4. Изучить влияние сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, и препаратов, обладающих антиоксидантной активностью, в том числе и флавоноидов на углеводный, липидный и гормональный статус животных с ЭСД и НПГ. 5. Изучить влияние наиболее активных веществ из вновь синтезированныхпроизводных ГАМК, флавоноидов и препаратов сравнения на противовоспалительную функцию эндотелия при ЭСД и НПГ. 6. Дать морфологическую оценку состояния эндотелия при ЭСД и НПГ и изучить влияние наиболее активных веществ из вновь синтезированных и препаратов сравнения на морфологическую структуру эндотелия. 7. Изучить механизм эндотелиопротективного действия наиболее активных веществ из вновь синтезированных и препаратов сравнения у животных с ЭСД и НПГ с помощью иммуногистохимического исследования, с оценкой уровня экспрессии e-NOS, эндотелина-1, каспазы -3, nF-kB, рецепторов TREIL. 8. На основании сравнительного изучения влияния на эндотелиальную функцию средств из различных фармакологических групп в условиях нормы и экспериментальной патологии, дать оценку методологии к подходам оценки эндотелиальной функции/дисфункции и эндотелиопротективного действия фармакологически активных соединений. Новизна исследования Впервые разработан комплексный подход изучения эндотелиотропных эффектов биологически активных веществ, 5 обоснована возможность моделирования эндотелиальной дисфункции с помощью стрептозотоцин индуцированного сахарного диабета и экспериментально вызванной недостаточности половых гормонов. Впервые выполнено сравнительное комплексное изучение влияния представителей различных фармакологических групп, среди сердечнососудистых средств, в сопоставимых условиях,: β-адреноблокаторов (небиволол, бисопролол), ингибиторов АПФ (лизиноприл), антагонистов кальциевых каналов (нифедипин), статинов (симвастатин), гипариноида сулодексида, ряда производных ГАМК (фенибут, пикамилон, РГПУ-189, РГПУ-147), веществ, обладающих антиоксидантной активностью (мексидол, предуктал, дибикор), а также флавоноидов (гесперидин, диосмин, кверцетин и флавицин), на вазодилатирующую, антитромботическую функции, на углеводный, липидный обмен и гормональный статус при ЭСД и НПГ. Показано их неоднозначное эндотелиопротекторное действие. Впервые выявлена высокая эндотелиопротективная активность и комплексно изучено влияние нового производного ГАМК – соединения РГПУ-189 и флавоноида - флавицина на вазодилатирующую, антитромботическую, противовоспалительную и пролиферативную функции эндотелия при ЭСД и НПГ. По выраженности эндотелиопротекторного действия РГПУ-189 и флавицин превосходят небилет, конкор, мексидол, предуктал, дибикор, нифедипин, фенибут, пикамилон, производное ГАМК - РГПУ-147 и флавоноиды, приближаясь по выраженности действия к Сулодексиду. Впервые установлено усиление активности е-NOS, снижение эндотелина-1, а так же снижение экспрессии основных генетических маркеров запускающих апоптоз (каспаза-3, «доменов смерти», NF-kB) у животных с ЭСД и НПГ, под влиянием соединения РГПУ-189и флавоноида флавицина, что очевидно лежит в основе их эндотелиопротекторного действия. 6 Научно-практическая ценность работы Используемый комплексный морфо-функциональный подход может применяться для оценки антитромботической, степени ЭД противовоспалительной, (вазодилатирующей, антипролиферативной функций эндотелия), мощности функционирования NO системы, дает возможность оценить эндотелиотропные свойства исследуемых веществ. Сравнительный анализ полученных данных о влиянии известных сердечно-сосудистых средств, позволит более дифференцированно их использовать при лечении больных с различной кардиологической патологией, а на основе флавоноидов и производных ГАМК – разработать лекарственные средства для лечения ЭД различного генеза. Полученные данные об эндотелиопротективном действии производных ГАМК и флавоноидов свидетельствуют о перспективности дальнейшей разработки на основе соединения РГПУ-189 и флавицина эндотелиопротекторов для применения в качестве средств профилактики и лечения сосудистых осложнений различного генеза, обусловленных ЭД. Реализация результатов. На основании данных диссертационного исследования разработана дальнейшая программа целенаправленного поиска веществ с сердечнососудистыми и эндотелиотропными свойствами среди структурных аналогов ГАМК (кафедра органической химии Российского Государственного Педагогического Университета им. А.И.Герцена (г. Санкт-Петербург)), предложен план поиска веществ флавоновой природы для профилактики и лечения сосудистых осложнений, обусловленных СД и НПГ (Пятигорская фармацевтическая академия). Разработанная комплексная морфофункциональная система поиска и доклинического фармакологического эндотелиопртективной активностью изучения используется веществ в с научно- исследовательской работе кафедры фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета (ВолгГМУ), 7 НИИ фармакологии ВолгГМУ, кафедрах фармакологии ВолгГМУ и Пятигорской государственной фармацевтической академии. Полученные в ходе исследования результаты оформлены в виде методического пособия «Новая медицинская технология: Использование высокочастотной ультразвуковой допплерографии для изучения влияния фармакологических веществ на региональное кровообращение и эндотелиальную функцию (подписано в печать 04.2010) Полученные результаты о эндотелиопротекторных свойствах новых производных гамма-аминомасляной кислоты и флавоноидов, а так же сравнительная эндотелиопротекторная активность сердечно-сосудистых средств и веществ, обладающих антиоксидантной активностью, включены в раздел учебных программ курса фармакологии на кафедрах фармакологии и биофармации ФУВ, фармакологии, клинической фармакологии интенсивной терапии Волгоградского государственного и медицинского университета, кафедре биохимии и микробиологии, кафедре органической химии Пятигорской государственной фармацевтической академии, кафедрах фармакологии Воронежской государственного медицинской медицинского академии, университета, Ростовского Белгородского государственного университета. Материалы работы оформлены в виде информационных флавоноидов писем при “Изучение эндотелиопротекторных экспериментальном сахарном свойств диабете”, «Эндотелиопротективные свойства производных ГАМК при недостаточности половых гормонов» которые используются в учебном процессе и научной работе кафедры фармакологии ВолгГМУ (акты о внедрении от 09.2010; 12.2010), фармакологии и биофармации ФУВ ВолгГМУ (акты о внедрении от 09.2010; 12.2010), лаборатории фармакологии сердечно-сосудистых средств НИИ фармакологии ВолгГМУ (акты о внедрении от 09.2010; 12.2010). По материалам настоящей работы получен 1 патент Российской Федерации на изобретение. 8 Положения, выносимые на защиту: 1. Стрептозотоцин-индуцированный сахарный диабет в большей степени, а экспериментально вызванная недостаточность половых гормонов, в меньшей степени, приводят к выраженным нарушениям всех функций эндотелия. Операционная травма так же приводит к эндотелиальным нарушениям, однако они носят кратковременный и обратимый характер. Полученные результаты позволяют рекомендовать данные патологические модели для моделирования эндотелиальной дисфункции в эксперименте. 2. Используемый в работе комплексный морфо-функциональный подход к изучению противовоспалительной, вазодилатирующей, антипролиферативной антитромботической, функций эндотелия, позволяет оценить стабильность и мощность функционирования NO системы и выраженность ЭД, а также может использоваться для изучения эндотелиотропных эффектов исследуемых веществ и различных патологических воздействий на эндотелий. 3. Сердечно-сосудистые производные ГАМК, средства, флавоноиды гепариноид и – сулодексид, вещества, обладающие антиоксидантными свойствами, в разной степени выраженности проявляют эндотелиопротективную активность, что проявляется в улучшении вазодилатирующей, антитромботической функций эндотелия. По степени улучшения вазодилатирующей функции эндотелия все исследуемые соединения можно расположить следующим образом: Вессел Дуэ Ф (сулодексид) > Диротон ≥ Симвагексал ≥ Небилет > РГПУ-189 > Флавицин ≥ РГПУ-147 > Кверцетин ≥ Мексидол > Конкор > Гесперидин > Диосмин > Предуктал > Пикамилон > Нифедипин ≥ Фенибут ≥ Дибикор, а по степени влияния на антитромботическую функцию эндотелия изучаемые соединения можно расставить в следующем порядке: Вессел Дуэ Ф (сулодексид) ≥ Симвагексал ≥ РГПУ-189 > Диротон > Небилет > РГПУ-147≥ Флавицин > Кверцетин ≥ Конкор > Нифедипин > Мексидол > Фенибут ≥ Гесперидин ≥ Дибикор > Диосмин ≥ Предуктал > Пикамилон. 9 4. РГПУ-189 и противовоспалительную, флавицин выражено антипролиферативную функции улучшают эндотелия, уменьшают метаболические нарушения у животных с ЭСД и НПГ (снижают гипергликемию, гиперхолестеринемию, индекс атерогенности), в большей степени эти эффекты выражены у флавицина. Эндотелиопротективное действие отмеченных веществ очевидно обусловлено угнетением экспрессии маркеров апоптоза (TRАIL, каспаза-3, nF-kB), снижением эндотелина-1 и усилением активности е-NOS. 5. Вессел Дуэ Ф по совокупности всех проведенных исследований оказал наиболее выраженное эндотелиопротекторное действие по сравнению со всеми исследуемыми веществами. Полученные результаты позволяют рекомендовать Вессел Дуэ Ф в качестве эталонного препарата сравнения при сопоставлении эндотелиотропных эффектов изучаемых лекарственных препаратов. 6. Сравнительный анализ полученных данных о влиянии известных сердечно-сосудистых средств, флавоноидов, веществ, обладающих антиоксидантной активностью, и производных ГАМК на эндотелиальную дисфункцию в условиях гормональных нарушений различного генеза, свидетельствуют о целесообразности применения Весел Дуэ Ф, диротона, симваГЕКСАЛА, небилета, мексидола, для комплексной терапии сердечнососудистых заболеваний, профилактики и лечения сосудистых осложнений, связанных с СД и НПГ. Результаты исследований позволяют рекомендовать проведение дальнейшего изучения соединения РГПУ-189 и флавицина, для создания на их основе новых препаратов с эндотелиопротекторной активностью. 7. Проведенное тестирование вазодилатирующей функции эндотелия различных сосудистых регионов (мозг, печень, почка и кожно мышечная область) позволяет говорить о том, что направленность эндотелиального ответа одинакова во всех областях, но выраженность разная. Результаты исследования дают возможность экстраполировать полученные в ходе 10 эксперимента данные по изменению функции эндотелия в одной сосудистой области и на другие регионы с разным типом эндотелия. Апробация работы Материалы работы докладывались и обсуждались на 5-ой научнопрактической конференции «Методы исследования регионального кровообращения и микроциркуляции в клинике» (Санкт-Петербург, 2005); на II международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (Алматы, Казахстан, 2007); на 13 Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2007); Научно-практической конференции «Диагностика и коррекция нарушений регионального кровообращения и микроциркуляции в клинической практики» (Саратов, 2008); на 14 Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2008); на VIII съезде кардиологов южного федерального округа «Совершенствование оказания медицинской помощи больным с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Новые подходы и перспективы» (Ростов-на-Дону, 2009); 56-ой региональной научно-практической конференции Волгоградского государственного медицинского университета «Инновационные достижения фундаментальных и прикладных медицинских исследований в развитии здравоохранении волгоградской области» (Волгоград 2009); Научно практической конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии» (Волгоград, 2010); II Всероссийском научно-практическом семинаре “Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии” (Волгоград, 2010). По материалам диссертации опубликовано 60 печатных работ, в том числе 21 работ в журналах, рекомендуемых ВАК, получен 1 патент на изобретение №2374699 от 27 ноября 2009 года. Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 6 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 493 источника, из 11 них 189 отечественных и 304 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 296 страницах машинописного текста, содержит таблиц –27, рисунков –55, схем – 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование выполнено на 1090 крысах самках и самцах, которые содержались в условиях вивария с естественным световым режимом, на стандартной диете лабораторных животных (ГОСТР 50258-92), с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях, а также правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-96) и Приказу МЗ РФ №267 от 19.06.2003г. «Об утверждении правил лабораторной практики» (GLP). Животные были получены из питомников «Столбовая», «Рапполово». Эксперименты были одобрены комитетом по этической экспертизе доклинических исследований ВолгГМУ (протокол № 54-2007 от 28.04.2007). Исследование было проведено с помощью комплексного морфофункционального подхода, используемого для оценки эндотелиальной дисфункции (ЭД) и эндотелиотропного действия (ЭПД) веществ. Комплексный морфо-функциональный подход включал в себя определение вазодилатирующей, антипролиферативной антитромботической, функций противовоспалительной эндотелия. При и изучении эндотелиопротекторного действия на животных с ЭСД дополнительно оценивались нарушения в углеводном и липидном обмене, с целью оценки влияния соединений на развитие ЭД. Кроме этого, у всех групп животных с экспериментально-вызванной недостаточностью половых гормонов определялся уровень половых гормонов в плазме крови. ЭД на всех этапах исследования моделировалась двумя патологиями стрептозотоцин-индуцированным СД и недостаточностью половых гормонов (НПГ). 12 Экспериментальный сахарный диабет (ЭСД) вызывали введением стрептозотоцина в дозе 45 мг/кг внутривенно в хвостовую вену. Через 72 часа производили количественное определение глюкозы в крови ферментативным (глюкозооксидазным методом) с измерением величины оптической плотности надосадочной жидкости в кюветах с длиной оптического пути 10 мм при длине волны 500 на спектрофотометре (ПЭ5400В, ЭКРОС) с использованием наборов «Глюкоза ФКД» (Россия). За 18 часов до введения цитотоксина крысам ограничивали доступ к пище при свободном доступе к воде. В дальнейшее исследование отбирали животных с уровнем сахара крови 12-15 ммоль/л и выше, то есть крыс с развившимся СД (Баранов В.Г., 1983). Недостаточность половых гормонов (НПГ) как модель нарушения функции эндотелия воспроизводилась путем экстирпации матки с придатками у крыс самок. Исследование проводилось на крысах-самках, рандомизированных по массе (180-210 гр.) и возрасту (половозрелые – 3 месяца) (патент на изобретение №2374699). С целью оценки изменения уровня гормонов в исследуемых группах при моделировании недостаточности половых гормонов был использован иммуноферментный анализ (ИФА) с помощью автоматического ридера Elx800 и с использованием наборов: Прогестерон ELISA EIA-1561, Пролактин ELISA EIA-1291, Фолликулостимулирующий гормон ELISA EIA-1288, Эстрадиол ELISA EIA-2693 (DRG Instruments GmbH, Германия). Контроль эффективности кастрации производился с использованием цитологического метода определения стадии полового цикла у самок. Для анализа разного уровня эндогенных эстрогенов после операции были выбраны три наиболее характерные фазы полового цикла: диэструс, проэструс и эструс. Определение фаз полового цикла (диэструс, проэструс, эструс) у интактных крыс проводили с помощью характерных морфологических признаков по влагалищным мазкам согласно описанию Я. Д. Киршенблата. 13 Все проведенные нами исследования проходили тремя блокаи в несколько этапов. В первом блоке, на первом этапе работы, проводили сравнительное изучение вазодилатирующей функции эндотелия сосудов головного мозга, печени, почек и кожно- мышечной области, на фоне модификации синтеза эндогенного оксида азота у интактных животных. На втором этапе работы оценивалась выраженность и продолжительность эндотелиальной дисфункции у животных с экспериментально вызванными - сахарным диабетом, недостаточностью половых гормонов и операционной травмой (операционным стрессом), как патологии сопутствующей хирургической кастрации (для исключения ее влияния на развитие эндотелиальных нарушений). В ходе проведения второго этапа исследований использовались методические приемы, позволяющие оценить вазодилатирующую и антитромботическую функции эндотелия (таблица 1). Дальнейшие эксперименты проводились еще двумя отдельными блоками. Так, во втором и третьем блоке исследований изучалось эндотелиопротективное действие сердечно-сосудистых средств: ингибиторов АПФ, антагонистов кальциевых каналов, статинов, сулодексида, флавоноидов, производных ГАМК у животных с ЭСД и НПГ (3 этап) (таблица 1). Эндотелиопротекторные свойства изучались среди: - сердечно-сосудистых средств: ингибитор АПФ – лизиноприл (диротон, «Гедеон Рихтер А.О., Будапешт – Венгрия») - 5мг/кг; b - блокаторы – небивалол (небилет, «Berlin-Chemie», Берлин, Германия)– 2,5мг/кг, и бисопролол (конкор «Nykomed», МеркКГаА, Германия для Никомед) – 5мг/кг; антагонист кальциевых каналов – нифедипин (BalkanpharmaR) – 10мг/кг; гипохолестеринимический препарат –симвастатин ( симваГЕКСАЛ, 14 2 этап изучение эндотелиальной дисфункции при ЭСД, НПГ* и ХТ.** 3 этап Изучение эндотелиопротективного действия исследуемых веществ при ЭСД и НПГ 2-ой и 3-й блок* 1 блок 1 этап гетерогенность эндотелия # Таблица 1 - Дизайн проведения экспериментов Вазодилатирующая функция эндотелия доплеровская флоуметрия при модификации синтеза NO (оценка ЭЗВД при введении ацетилхолина, N-Lаргинина) Вазодилатирующая функция эндотелия -доплеровская флоуметрия при модификации синтеза NO (оценка ЭЗВД при введении ацетилхолина, Lаргинина, N-L-аргинина; ЭНЗВД при введении нитроглицерина; мощности и стабильности NOсинтазной системы при многократном введении АЦХ) Антитромботическая функция эндотелия -скорость образования тромба (артериальный тромбоз) - измерение вязкости крови -оценка агрегации тромбоцитов - тромбиновое время - протромбиновое время -активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) -содержание фибриногена -определение фактора Виллебрандта -доплеровская флоуметрия при модификации синтеза NO (оценка ЭЗВД при введении ацетилхолина, Lаргинина, N-L-аргинина; ЭНЗВД при введении нитроглицерина; мощности и стабильности NOсинтазной системы при многократном введении АЦХ) Вазодилатирующая функция эндотелия Антитромботическая функция эндотелия -скорость образования тромба (артериальный тромбоз) - измерение вязкости крови -оценка агрегации тромбоцитов - тромбиновое время - протромбиновое время -активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) -содержание фибриногена -определение фактора Виллебрандта Оценка метаболических эффектов -уровень глюкозы в крови -липидный спектр (ХСобщ, ХСЛПВП, ХСЛПНП ТГ, индекс атерогенности) -уровень эстрогенов Оценка гормонального статуса у животных с НПГ Противоспалительная функция эндотелия Антипролиферативная функция эндотелия -уровень СРБ -морфометрическая оценка мозговых сосудов с наличием признаков пролиферации, а так же воспаления, тромбообразования ультраструктурная оценка эндотелиальных повреждений - иммуногистохимическая оценка по степени экспрессии и уровню оптической плотности антител Структурные изменения эндотелиоцитов Определение уровня еNOS и эндотелина-1, TRAIL, NF-kB, каспаза-3 Примечание: #-исследование проведено на интактных животных; *- исследование проведено через 4 недели после ЭСД и НПГ; **-исследование проведено в течении 4-х дней после оперативного вмешательства 15 HEXAL, Германия) – 10 мг/кг. Дозы препаратов выбраны на основе литературного анализа многочисленных экспериментальных исследований, в которых эти вещества проявили высокую эндотелиопротекторную, антигипертензивную, противоишемическую и гипохолестеринемическую активность. - производных ГАМК: РГПУ-147 (50мг/кг), РГПУ-189 (15мг/кг), фенибут - (25мг/кг), пикамилон (ОАО «Фармстандарт-УфаВИТА») 100мг/кг. Использовались наиболее эффективные дозы данных веществ, выявленные при антиишемической изучении и нейропротекторной, кардиотропной активности антистрессорной, данных соединений. Вещества синтезированы на кафедре органической химии Российского государственного педагогического университета им. А.Н. Герцена (СанктПетербург, Россия)1. - веществ, обладающих антиоксидантными свойствами: мексидол (“НПК Фармасофт”, Россия) в дозе 100 мг/кг; предуктал МВ (триметазидин, “Servier”, Франция) в дозе 6 мг/кг; дибикор (таурин “ПИК-ФАРМА ПРО”) в дозе 168 мг/кг. - индивидуальных флавоноидов: кверцетин (фирмы Merck), а также флавицин, диосмин, полученные из надземной части растения рода Vicia, сем. Fabaceae) и гесперидин, полученный из кожуры цитрусовых, выделенные на кафедре органической химии Пятигорской фармацевтической академии под руководством доктора фармацевтических наук, профессора Э.Т. Оганесяна, за что выражаем ему искреннюю благодарность. Все флавоноиды вводились в дозе - 100мг/кг, способ введения - per os. Так же был исследован Сулодексид (Весел Дуэ Ф)– 30 ЕВЛ (единицы высвобождения липопротеинлипазы) (Аlfa Wassermann, Италия) (Комелягина Е.Ю., 2005). Способ введения всех перечисленных веществ - per os, в течении месяца, в первую половину дня. В качестве растворителя использовали 0,9% Выражаем искреннюю благодарность зав.кафедрой органической химии РГПУ им.А.И..Герцена , з.д.н., д.х.н., проф. Берестовицкой В.М., к.х.н., доц. Васильевой О.С. и всем сотрудникам кафедры за предоставленные для исследования вещества 1 16 раствор хлорида натрия. Контрольным группам животных: интактным, ложнооперированным (ЛО), а также животным с НПГ и ЭСД вводился физиологический раствор в эквивалентном объеме. Оценка вазодилатирующей функции эндотелия осуществлялась путем регистрации изменений скорости кровотока (СК) при модификации синтеза эндогенного оксида азота введением ацетилхолина (АЦХ) (0,01 мг/кг), L-аргинина (300 мг/кг), нитро-L-аргинина («Acros organics», США) (10 мг/кг). Для оценки эндотелионезависимой вазодилатации (ЭНЗВД) в/в вводили нитроглицерин (НТГ) (МТХ, Москва) (0,007 мг/кг). Для оценки мощности и стабильности NO-синтазной системы был использован метод многократного (10-кратного) введения АЦХ в фиксированной дозе (0,01 мг/кг). СК регистрировали в теменной области мозга крыс, в проекции среднемозговой артерии с помощью ультразвукового допплерографа, датчика УЗОП-010-01 (рабочая частота 25МГц, диаметром 0,3 см) и компьютерной программы ММ-Д-КMinimax Doppler v.1.9. (Санкт-Петербург, Россия), которая дополнительно позволяла анализировать периферическое сопротивление (индекс Пурселло) и эластичность мозговых сосудов (индекс Гослинга). Оценка антитромботической функции исследуемых соединений осуществлялась с помощью комплексного подхода для оценки как сосудисто-тромбоцитарного, так и плазменного (коагуляционного) гемостаза. Артериальный тромбоз вызывался по методике Angelillo-Scherrer A., 2004. Показатели вязкости крови изучались на анализаторе крови реологическом АКР-2 (Россия), показатели агрегации тромбоцитов на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов фирмы "Биола" (г. Москва) по методу Born G. (1962) в модификации Габбасова З.А. (1989). Тромбиновое время (ТВ), протромбиновое время (ПВ), активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) и содержание фибриногена определяли хронометрически на анализаторе показателей гемостаза АПГ2-01 “МИНИЛАБ 701” с использованием наборов НПО «Ренам» (Россия). 17 Определение фактора Виллебранда проводилось на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов "Биола" (наборы “Ренам” для определения фактора Вллебранда). Оценка липидного профиля (ХСобщ, ХСЛПВП, ХСЛПНП, ТГ) осуществлялась с использованием ферментативных колориметрических тестов “Ольвекс Диагностикум”), значение концентрации ХСЛПНП вычисляли по формуле Фридвальда (1972), индекс атерогенности (ИАТ) по А.Н. Климову (1999). Уровень глюкозы в плазме крови крыс определялся глюкозооксидантым способом с использованием набора «Глюкоза-ФКД» (Россия). Противовоспалительная функция эндотелия оценивалась по уровню С-реактивного белка (СРБ) с помощью набора реагентов для качественного и полуколичественного определения СРБ в сыворотке крови методом латексагглютинации (”Ольвекс Диагностикум”). Антипролиферативная функция эндотелия оценивалась с помощью комплексного морфологического подхода, основанного на морфометрической оценке параметров эндотелиальных клеток (размеры ядер (ус.ед.) и ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО)), степени сосудистых и эндотелиальных нарушений на базе компьютерной системы «ВидеоТестМорфо-4» (Россия), по соотношению интимы/медии эндотелиальной выстилки, признаков пролиферации сосудистой стенки и воспалительной инфильтрации в микроциркуляторном русле, а также явлений периваскулярного и перицеллюлярного отёка. Для определения степени повреждения эндотелия проводилась гистологическая оценка десквамации (циркулирующие эндотелиоциты). Определение количества десквамированных эндотелиоцитов осуществлялось с помощью метода, основанного на изоляции клеток эндотелия вместе с тромбоцитами с последующим осаждением тромбоцитов с помощью АДФ (Петрищев Н.Н., 2001; Hladovec J., 1978). Для электронномикроскопического исследования эндотелия забор фрагментов головного мозга производили с областей, где по данным 18 световой микроскопии наблюдались наибольшие патологические изменения в микроциркуляторном русле, наиболее сильно затрагивающие эндотелиальную выстилку. Фрагмент объемом около 1 мм3 фиксировали в 1 % растворе глютарового альдегида 4 часа, и в течение 2 часов в 1 % растворе четырехокиси осмия на веррналацетатном буфере при температуре + 4° С. Затем материал подвергали дегидратации в серии спиртов возрастающей концентрации, проводили в окиси пропилена и заливали в эпоксидную смолу ERL-4206 (A.Spurr, 1968). Определение уровня еNOS и эндотелина-1, маркеров апоптоза: каспазы-3, рецепторов TRАIL, NF-kB. Для гистологического исследования под эфирным наркозом производили забор головного мозга крыс. Материал фиксировали в течение 48 часов в 10% растворе нейтрального забуференного формалина (рН 7,4). После фиксации материал проводили по общепринятой гистологической методике через батарею спиртов возрастающей концентрации, хлороформ и заливали в парафин. На роторном микротоме изготавливали серийные срезы толщиной 5-6 мкм. В дальнейшем производили окрашивание гематоксилином и эозином по общепринятой гистологической методике (депарафинизация в ксилоле, проводка по спиртам убывающей концентрации до воды, окраска гематоксилином Бёмера, дифференцировка солянокислым спиртом, окраска эозином, проводка по спиртам возрастающей концентрации до абсолютного этанола, просветление в ксилоле, заключение в канадский бальзам). Для выявления степени функционирования эндотелия мозга в условиях стрептозотоцинового сахарного диабета, экспериментально вызванной недостаточности половых гормонов и эндотелиопротективного действия изучаемых веществ при данных патологиях оценивали оптическую плотность и использовали моноклональные антитела к эндотелину-1 (Endothelin-1 Receptor (ETA), Clone RJT 24, NCL-L-ETA P (HIER)) и моноклональные антитела к эндотелиальной NOS (Nitric Oxid Synthase, Clone RN5, NCL-NOS-3 F P (HIER)), к каспазе 3 (клон JHM62, Novocastra), к 19 рецептору TRAIL - апоптоз-индуцирующий лиганд (клон 27B12, Novocastra), к транскрипционному фактору NF-kB (NF-kappa B p65, BioGenex). Визуализацию проводили с помощью непрямого иммунопероксидазного метода с высокотемпературной и ферментной демаскировкой антигенов. Индекс апопотоза рассчитывали как отношение эндотелиальных клеток с имуногистохимическими признаками апопотоза к нормальным эндотелиоцитам (%). Для достоверности полученных результатов применяли позитивные контроли антигенов недифференцированном (лимфатические узлы, негативные контроли лейкозе), печень при антигенов (предстательная железа, головной мозг) и негативные контроли антител (обработка срезов без нанесения первичных антител). Для анализа морфологических показателей производили микрофотосъемку цифровой камерой Canon (Japan, 5.0 мегапикселей) на базе микроскопа Axiostar plus (Карл Цейс, Германия) с использованием объектива х40, х100 и окуляра х10. Оценивали процентное отношение иммунопозитивных клеток к общему количеству эндотелиальных клеток мозга. Статистическая обработка результатов исследования: нормальность распределения выполнялась с использованием W критерия Шапиро-Уилка; анализ статистической значимости различий проводился с применением t-критерия Стьюдента; однофакторного дисперсионного анализа, критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони; однофакторного дисперсионного анализа Крускала-Уоллиса, критерия Дана для множественных сравнений; дисперсионного анализа повторных измерений, критерия Тьюки; критерия Фридмана для анализа повторных измерений, критерия Ньюмена—Кейлса Обработка данных производилась с помощью пакетов программ Microsoft Office Excel, BioStat 2008 5.2.5.0. 20 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Оценка вазодилатирующей функции эндотелия различных сосудистых регионов. Проведённый этап исследований позволяет дать суммарную оценку функционирования эндотелия различных сосудистых регионов, как в норме, так и при патологии различного генеза. Существенно то, что один и тот же датчик, размещенный над тканью органа, регистрирует кровоток в определенной, сопоставимой по массе ткани, а не во всем органе, поэтому возможно корректное сравнение скоростей кровотока или изменений (прироста/падения) кровотока в разных сосудистых регионах. А. Б. АЦХ н-Л-арг 45 0 40 -5 1 35 -10 30 -15 % % 25 20 15 -20 -25 10 -30 5 -35 0 -40 1 50 АЦХ 1 Мозговой кровоток Печеночный кровоток 40 % 30 20 10 0 Бедренный кровоток Почечный кровоток 1 Примечание: АЦХ - прирост кровотока в ответ на введение ацетилхолина; н-Л-арг- падение кровотока в ответ на введение нитро-Л-аргинина. Рисунок 1. Изменение мозгового, почечного, печеночного кровотока и кровотока в кожно-мышечной области при активации (А) (ацетилхолином) и подавлении (Б) (нLа) синтеза оксида азота. При введении АЦХ интактным животным скорость мозгового кровотока повышалась на 25%, в почечной ткани на 20%, в сосудах печеночной области (36%), в кожно-мышечной области кровоток увеличился на 19 % от исходного уровня. Введение нитро-L-аргинина приводило к снижению скорости кровотока в проекции среднемозговой артерии на 24,6%, 21 в почке на 18,2%, в печени на 32,2%, в кожно - мышечной области на 16,5% (рисунок 1 А,Б). Таким образом, введение АЦХ вызывало достоверное по отношению к исходным данным повышение, а нитро-L-аргинина - снижение скорости кровотока во всех изучаемых сосудистых регионах, однако наиболее сильный прирост и падение наблюдались в печеночной ткани, органе с наименьшей исходной скоростью кровотока. Такая сосудистая реакция, возможно, связана с анатомическим строением микроциркуляторного русла печени и нахождением там клеток Купфера, принимающих дополнительное участие в синтезе NO и активирующихся в результате воздействия различных стимулов (Маянский Д.Н., Висе Э., Декер К., 1993). Следует отметить, что регистрация кровотока в печени требует вскрытия брюшной полости и осложняется помехами связанными с близким расположением аорты, задней полой вены и диафрагмы легких. Исходя из этого, нами были выбраны в качестве объекта изучения эндотелиальных функций сосуды мозга т.к. в течение опыта, легче обеспечить регистрацию мозгового кровотока, а полученные в ходе работы результаты свидетельствуют о том, что направленность изменений сосудистого тонуса гетерогенных эндотелиальных областей одинакова. Оценка влияния ЭСД, НПГ и операционной травмы на эндотелиальную дисфункцию. У животных с ЭСД и НПГ наблюдается снижение стабильности и мощности эндотелиальной NO-синтазной системы, ослабление эндотелиозависимой вазодилатации на фоне ЭСД и НПГ в 1,7 раза и 2,3 раза, соответственно (Рисунок 2). Так же у животных с ЭСД и НПГ наблюдаются нарушения как со стороны коагуляционного (плазменного) гемостаза, так и со стороны сосудисто-тромбоцитарного (Рисунок 3,4). 22 А) Б) 60% 50% 40% 40% * ** 30% 20% 20% 10% 0% 0% Ацх НТГ N-Larg -20% О НТГ N-Larg -20% * -30% * НПГ Ацх -10% ЭСД -40% И нт акт Примечание: АЦХ – введение ацетилхолина; НТГ-введение нитроглицерина; nLarg-введение нитроLаргинина; НПГ-оперированные животные с удаленными маткой и придатками, ЛО – ложнооперированные крысы; ЭСД – животные с стрептозотацированным сахарным диабетом, Интак – интактные крысы, * - (P≤0,05); ** - (P≤0,01); достоверно по отношению к группам интактных и ЛО животных (Достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни) Рисунок 2. Изменения церебрального кровотока животных с НПГ (А) и с ЭСД (Б) при модификации выделения и синтеза эндогенного оксида азота. 20 0,9 Индекс агрегации тромбоцитов ** 18 Индекс дезагрегации тромбоцитов 0,8 0,7 16 0,6 14 0,5 12 ** 0,4 10 8 0,3 6 0,2 4 0,1 2 0 0 ЛО НПГ Интакт ЛО ЭСД ** 50 40 30 20 10 0 ЛО НПГ Интакт Интакт ЭСД Примечание: НПГ-оперированные животные с удаленными маткой и придатками, ЛО – ложнооперированные крысы; ЭСД – животные с стрептозотацированным сахарным диабетом, Интак – интактные крысы, * - (P≤0,05); ** (P≤0,01); достоверно по отношению к группам интактных и ЛО животных (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический U- критерий Манна-Уитни). Максимальный наклон 60 НПГ ЭСД Рисунок 3. Изменения индексов агрегации / дезагрегации тромбоцитов и максимального наклона у животных с недостаточностью половых гормонов и с сахарным диабетом. Антикоагулянтный и антитромбогенный потенциал сосудистого эндотелия смещается в сторону повышения показателей агрегации тромбоцитов (повышение индекса агрегации тромбоцитов в 1,75 раза при НПГ и 2,25 раза при ЭСД, скорости агрегации в 1,6 раза при НПГ и 1,79 раза при ЭСД, снижение индекса дезагрегации тромбоцитов в 2,86 раза при НПГ 23 и 3,14 раза при ЭСД). Увеличения скорости образования тромба на модели артериального тромбоза в 1,7 раза при НПГ и 2,6 раза при ЭСД (Рисунок 3,4). Под влиянием изучаемых патологий происходит достоверное (Р<0,05) укорочение тромбинового и протромбинового, а также активированного частичного тромбопластинового времени, повышение уровня фибриногена и фактора Виллебранда в крови (Рисунок 9), увеличение вязкости крови на скорость кровотока ус.ед. всех скоростях сдвига (Таблица7,8,9). 30 20 10 ** 0 1 мин 3мин 5 мин * ** ** 7мин 9мин 11мин ЭСД 13мин интакт 15мин 17мин 19мин 21мин НПГ Примечание: ЭСД – животные с стрептозотацированным сахарным диабетом, Интак – интактные крысы, НПГ-оперированные животные с удаленными маткой и придатками * - (P≤0,05); ** - (P≤0,01); достоверно по отношению к группам интактных животных (ранговый однофакторный анализ КрускалаУоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический U- критерий Манна-Уитни) Рисунок 4. Скорость образования тромба в сонных артериях у животных с НПГ и ЭСД, при аппликации хлорида железа на адвентицию сосуда. При оценке вазодилатирующей функции эндотелия при хирургической травме, у интактных животных, отмечено, что в ответ на введение анализаторов СК у животных в первые и четвертые сутки после операции не достоверно отличались друг от друга. Введение же модификаторов синтеза эндогенного оксида азота животным на второй и третий день после операции вызывало повышение скорости кровотока значительно ниже по сравнению со скоростью кровотока животных, тестируемых в первый и четвертый день. Введение L-аргинина животным на вторые и третьи сутки после операции приводило к достоверно значимому усилению кровотока в брюшине в отличии от животных прооперированных в первые сутки. Полученные данные свидетельствуют о физиологически обратимом процессе нарушения эндотелиальной функции при хирургическом вмешательстве (Рисунок 5). 24 50% именение кровотока % 40% 30% 20% 10% 0% АЦХ Ларг НТГ нЛарг -10% -20% 1 сутки 2 сутки 3 сутки 4 сутки Примечание: 1,2,3,4 - сутки-после проведенного оперативного вмешательства; АЦХ – введение ацетилхолина; Ларг-введение Lаргинина; НТГ-введение нитроглицерина; нЛарг-введение нитроLаргинина; Рисунок 5. Изменения кровотока брюшины у животных в различные сроки после оперативного вмешательства при модификации синтеза эндогенного оксида азота. Стоит отметить, что ЭСД (Таблица 2) и НПГ сопровождаются существенным повышением уровня ТГ, ХСЛПНП, ХСобщ и снижением ХСЛПВП, что приводит к увеличению индекса атерогенности (Таблица 2). Таблица 2. - Влияние ЭСД на показатели липидного спектра крови у животных (ммоль/л) Группы животных ХСобщ ХС ЛПВП ХС ЛПНП ТГ ИАТ Интакт 2,58±0,07 0,85±0,05 1,42±0,09 0,68±0,03 2,09±0,17 ЭСД 3,8±0,15** 0,61±0,03** 2,83±0,15** 0,8±0,03* 5,5±0,46** Примечание - * - (P≤0,05); ** - (P≤0,01); достоверно по отношению к группам интактных животных (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический U- критерий Манна-Уитни). Существенно то, что активация атерогенных процессов, на фоне ЭСД и НПГ может лежать в основе нарушения эндотелиальной функции и увеличения вязкости крови (Таблица 3) и, соответственно, скорости напряжения сдвига, так как деформабельность эритроцитов прямо коррелирует с гиперглицерхолестеринемией и повышением содержания липопротеидов низкой плотности (Ефимов А.С., 1989; Балашова Т.С., 1996; Patel R. P., Hogg N., Kim-Shapiro D. B., 2011). Нарушение функции эндотелия при ЭСД и НПГ, кроме всех выше перечисленных выраженными патофизиологических патологическими сдвигов, изменениями его сопровождается морфологического состояния (Загидуллин Ш.З., и д.р., 2010; Ohtani K., Dimmeler S., 2011). При 25 световой и электронной микроскопии, у животных с ЭСД и НПГ, выявлено усиление тромбообразования и лейкоцитарной инфильтрации, увеличение соотношения интима/медиа и количества циркулирующих эндотелиоцитов. Кроме этого, при НПГ в 1,5 раза и при ЭСД в 2,2 раза наблюдалось увеличение С-реактивного белка и, соответственно, усилении провоспалительного статуса эндотелия. Таблица 3. Влияние ЭСД и НПГ на вязкость крови крыс Группы животных Интакт ЭСД ЛО НПГ Скорость сдвига, сПз 300с-1 100с-1 3,64±0,35 4,58±0,31 4,95±0,18** 6,72±0,34** 3,55±0,14 4,7±0,32 4,15±0,19* 6,5±0,23** 50с-1 6,78±0,41 9,8±0,67*** 5,91±0,36 7,12±0,34** 10с-1 8,41±0,34 15,12±0,7*** 7,69±0,45 12,01±0,78** Примечание НПГ-оперированные животные с удаленными маткой и придатками, ЛО – ложнооперированные крысы; ЭСД – животные с стрептозотацированным сахарным диабетом, Интак – интактные крысы, * - (P≤0,05); ** - (P≤0,01); *** - (P≤0,001); достоверно по отношению к группам интактных и ЛО животных (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический U- критерий Манна-Уитни). Проведенный комплексный морфо-функциональный анализ развития и выраженности эндотелиальной дисфункции при ЭСД и НПГ позволяет говорить о высокой валидности предложенных нами моделей формирования нарушений функции эндотелия и адекватности подходов к выявлению эндотелиопротекторной активности фармакологических веществ. Оценка влияния сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, веществ, обладающих антиоксидантной активностью и флавоноидов на вазодилатирующую функцию эндотелия у животных с ЭСД и НПГ. У животных с ЭСД и НПГ, диротон, симвагексал, небилет достоверно улучшали вазодилатирующую функцию эндотелия, повышали стабильность системы синтеза NO. Конкор и нифедипин также положительно влияли на вазодилатирующую функцию эндотелия, хотя и в меньшей степени (Таблица 4). Полученные результаты о положительном влиянии сердечно-сосудистых средств на вазодилатирующую функцию эндотелия подтверждают ранее выполненные исследования (Стрюк Р.И., Воронков Л.Г., 2002, 2003, Jorge 26 PA., 2010; Kalipada Pahan, Weis M, Yamasaki, 2010) и впервые позволяют провести сравнительное ранжирование по данному виду активности как внутри группы сердечно-сосудистых средств, так и между другими классами фармакологических веществ, изучаемых в данном исследовании. Таблица 4. Изменения кровотока у животных с ЭСД при модификации синтеза NO на фоне введения сердечно-сосудистых средств Группы животных Интакт ЭСД ЭСД +Вессел Дуэ Ф ЭСД +Диротон Изменения кровотока при введении анализаторов от исходного уровня, в % Прирост кровотока Падение кровотока Ацетилхолин L-аргинин НитроN-L-аргинин глицерин 44,05±2,35 11,24±1,34 50,25±3,25 37,84±2,23 12,08±1,41* 53,19±4,34** 48,52±2,2 17,34±1,9* 28,54±2,54≠≠ 13,15±1,49≠≠ 47,7±3,27 32,03±2,18≠≠ 24,13±3,19≠≠ 17,32±1,85≠≠ 49,52±2,46 31,5±2,29≠≠ ЭСД+Симвагексал ЭСД +Небилет ЭСД+Конкор ЭСД +Нифедипин 23,45±1,51≠≠ 22,97±3,11≠≠ 17,71±2,43≠ 14,15±2,03 21,86±2,35≠≠ 23,91±2,21≠≠ 36,54±3,93≠ 40,81±2,5≠ 46,58±4,09 49,62±3,77 50,19±3,51 56,05±4,16 30,6±2,52≠≠ 29,13±2,5≠≠ 24,88±1,91≠ 19,89±1,52 ЛО 32,85±4,79 9,74±1,21 47,7±1,37 45,79±6,75 НПГ 13,81±2,16** 58,41±6,47** 51,67±1,87 15,03±2,91** НПГ+Вессел Дуэф 36,85 ±3,78≠≠ 15,23±1,84≠≠ 52,61±1,75 27,5±3,09≠≠ НПГ +Диротон 30,28±2,37≠≠ 17,29±2,4≠≠ 51,55±2,07 25,7±2,62≠≠ НПГ +Симвагексал 27,35±2,00≠≠ 21,47±1,75≠≠ 48,07±1,68 25,53±3,36≠≠ НПГ +Небилет 26,37±2,09≠≠ 20,26±2,1≠≠ 47,91±2,35 25,0±2,57≠≠ НПГ +Конкор 19,45±1,73≠ 33,37±2,65≠ 51,05±1,64 21,02±2,92≠ НПГ+Нифедипин 16,46±1,29≠ 44,53±2,08 55,58±1,33 17,01±2,05 Примечание НПГ-оперированные животные с удаленными маткой и придатками, ЛО – ложнооперированные крысы; ЭСД – группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; интакт - интактная группа животных; * - (P≤0,05); **-(P≤0,01) достоверно по отношению к группе интактных и ЛО животных; ≠ - (P≤0,05); ≠≠ (P≤0,01)- достоверно по отношению к группе животных с ЭСД и НПГ (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический U- критерий Манна-Уитни) Исследуемые производные ГАМК - соединения РГПУ-189 и РГПУ-147, достоверно улучшают ЭЗВД, фенибут и пикамилон в меньшей степени улучшают вазодилатирующую функцию эндотелия (Таблица 5) у животных с НПГ и ЭСД. 27 Таблица 5. Изменения кровотока при модификации синтеза NO у животных с ЭСД, получавших производные ГАМК Группы животных Интакт ЭСД ЭСД +РГПУ-189 ЭСД +РГПУ-147 ЭСД +Пикамилон ЭСД +Фенибут ЛО НПГ НПГ +РГПУ-189 НПГ +РГПУ-147 НПГ +Пикамилон НПГ +Фенибут Изменения кровотока при введении анализаторов от исходного уровня, в % Ацетилхолин L-аргинин Нитроглицерин N-L-аргинин 44,05±2,35 11,24±1,34 50,25±3,25 -37,84±2,23 10,23±0,51* 50,2±4,52** 50,91±2,15 -14,05±1,34* 17,61±0,73≠≠ 25,53±2,28≠≠ 53,22±4,25 -22,86±2,19≠≠ 16,23±0,75≠ 27,38±2,09≠ 47,48±2,74 -20,59±1,79≠≠ 11,83±0,89 40,17±3,48 52,37±5,62 -16,6±1,98 11,77±0,94 41,46±3,21 49,45±3,43 -15,45±1,84 36,24±1,94 8,81±0,94 46,73±3,01 -43,88±4,92 12,41±2,1* 63,54±6,26** 43,02±3,46 -13,55±2,93* 22,28±3,04≠≠ 27,45±2,58≠≠ 46,38±2,59 -20,69±2,76≠≠ 20,73±2,11≠ 29,7±2,71≠ 43,71±2,71 -19,47±2,52≠ 14,82±1,71 50,42±5,18 49,34±2,5 -15,89±1,86 14,21±2,07 50,07±5,37 57,33±4,43 -14,76±1,33 Примечание – обозначения как в таблице 4. Таблица 6. - Изменения прироста кровотока у животных с ЭСД на фоне введения веществ с анитоксидантной активностью Группы животных Интакт ЭСД ЭСД +Флавицин ЭСД +Диосмин ЭСД+Кверцетин ЭСД+Гесперидин Изменения кровотока при введении анализаторов от исходного уровня, в % Ацетилхолин L-аргинин Нитроглицерин N-L-аргинин 39,41±2,24 7,48±1,09 43,95±2,77 -35,66±2,11 11,04±1,58* 45,56±5,87** 48,61±3,27 -15,07±2,17** 18,48±1,93≠≠ 21,89±2,84≠≠ 47,55±3,64 -23,4±2,3≠≠ 14,14±1,61 32,92±4,03 49,94±4,00 -18,74±1,76 17,2±2,37≠ 25,25±3,36≠ 50,47±3,03 -21,52±2,05≠ 15,03±1,95 34,34±3,06≠ 52,48±1,68 -20,25±1,74≠ ЭСД +Мексидол ЭСД+Предуктал ЭСД +Дибикор 15,74±1,48 13,65±1,3 12,36±1,3 41,79±5,38 ЛО 14,57±2,03* НПГ НПГ +Флавицин 25,02±2,46≠≠ НПГ +Диосмин 19,0±1,16≠ НПГ +Кверцетин 23,92±1,43≠≠ НПГ +Гесперидин 19,51±1,13≠ НПГ +Мексидол 20,59±1,4≠ НПГ +Предуктал 18,07±1,8≠ НПГ +Дибикор 16,5±1,65 29,71±3,51≠≠ 36,21±3,62 38,75±3,54 8,69±1,41 50,22±6,94** 20,88±2,48≠≠ 32,31±3,69≠ 24,23±1,37≠≠ 35,87±2,33≠ 30,69±3,21≠≠ 38,45±4,07≠ 38,76±4,59≠ Примечание – обозначения как в таблице 4. 28 54,85±2,57 49,92±3,38 50,17±3,37 48,51±0,98 50,76±1,93 48,94±1,3 47,54±2,33 50,99±2,21 45,69±3,3 53,11±1,58 48,3±1,3 47,54±2,33 -21,51±1,92≠ -18,63±1,38 -16,35±1,69 -38,09±4,51 -13,65±2,27* -20,0±2,09≠≠ -16,3±1,71 -19,5±0,82≠ -18,67±1,42≠≠ -19,14±1,73≠≠ -16,84±1,45 -14,72±1,5 Среди исследуемых флавоноидов (кверцетин, флавицин, диосмин, гесперидин) и соединений с антиоксидантным действием (мексидол, предуктал и дибикор) наиболее выраженное действие на ЭЗВД оказали флавицин, кверцетин и мексидол. Другие вещества менее выражено улучшали ЭЗВД у животных с ЭСД и НПГ (Таблица 6). Сравнивая параметры прироста и падения скорости кровотока в ответ на активацию и блокаду синтеза NO у контрольных животных с ЭСД и НПГ без фармакологической поддержки и у животных, получавших изучаемые соединения, можно расположить вещества из разных фармакологических групп в порядке убывания по степени улучшения ЭЗВД в следующем порядке: Вессел Дуэ Ф > Диротон ≥ Симвагексал ≥ Небилет > РГПУ-189 > Флавицин ≥ РГПУ-147 > Кверцетин ≥ Мексидол > Конкор > Гесперидин > Диосмин > Предуктал > Пикамилон > Нифедипин ≥ Фенибут ≥ Дибикор. Оценка влияния сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, веществ, обладающих антиокидантной активностью и флавоноидов на антитромботическую функцию эндотелия у животных с ЭСД и НПГ. Так как ЭПД одних и тех же соединений при разных экспериментальных патологиях была сопоставима, а более выраженная ЭД наблюдалась при ЭСД, то в дальнейшем в автореферате нами представлены рисунки и таблицы по изучению ЭПД веществ только в условиях данной патологии. Сосудистый эндотелий обладает высокой тромборезистентностью и играет важную роль в сохранении жидкого состояния крови и предупреждении тромбозов, обеспечении адекватной потребностям тканей микроциркуляции (Fitzgerald D.J. 2001; Zaheer Z., Robinson T., Mistri A.K., 2011). Поэтому в комплексном изучении эдотелиотропного действия исследуемых соединений мы изучали их влияние на антитромботическую функцию эндотелия. 29 Изучение влияния сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, флавоноидов и веществ, обладающих антиоксидантными свойствами, на тромбоцитарный и коагуляционный гемостаз, показало, что все исследуемые соединения обладают способностью повышать антитромбогенный и антикоагуляционный потенциал эндотелия при эндотелиальной дисфункции, вызванной ЭСД (Рисунок 6,7,8,9) и НПГ. Б) Усл.ед. И Д+ В Э С ир от он им ва ге кс Э С ал Д+ Н еб ил Э ет С Д+ Э Ко С Д+ нк ор Н иф ед ип ин нт ак т Д уэ Д ф +Д Э С ир Д +С от им он ва ге Э кс С ал Д +Н еб ил Э С ет Д +К Э С он Д +Н ко иф р ед ип ин С Э С Э Э С Д +В ес се л Э С Д И Усл.ед. нт ак т 0 # Д+ С 5 # ** Ду эф ## # Д+ Д ## 10 ## # Э ## ## Д 15 Индекс дезагрегации тромбоцитов 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 С ** Э Индекс агрегации тромбоцитов 20 ес се л 25 С А) Примечание - ЭСД – группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; интакт интактная группа животных; * - (P≤0,05); **-(P≤0,01) достоверно по отношению к группе интактных животных; ≠ - (P≤0,05); ≠≠ (P≤0,01)- достоверно по отношению к группе животных с ЭСД; (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический U- критерий Манна-Уитни). Рисунок 6. - Влияние сердечно-сосудистых средств на индекс агрегации и индекс дезагрегации тромбоцитов у животных с ЭСД А) Б) 25 0,9 0,8 Индекс агрегации тромбоцитов 20 ** # 15 ## 10 ## ## ## # # ** 0,4 0,3 0,2 5 ут иб он Д +Ф ен Э С ам ил 7 Э С Д +П ик У14 9 Э С Д +Р ГП У18 уэ ф Д Э С л се Д +В ес Э С Усл.ед. И Э С Д +Р ГП Э С кт нт а ил он Д +Ф ен иб ут 7 ам Д +П ик У14 9 У18 Д +Р ГП Э С Д +Р ГП Э С Э С Э С Д +В ес се л Д уэ ф Д Э С кт нт а Д 0,1 0 0 Усл.ед. И Индекс дезагрегации тромбоцитов 0,7 0,6 0,5 Примечание - обозначения, как на рисунке 6. Рисунок 7. - Влияние производных ГАМК на индекс агрегации и индекс дезагрегации тромбоцитов у животных с ЭСД Стоит отметить, что наиболее выраженное влияние на антитромботическую функцию эндотелия среди сердечно-сосудистых средств проявил Весел Дуэ Ф, симвагексал, из группы производных ГАМК – соединение РГПУ-189 и из флавоноидов – флавицин, которые лишь 30 незначительно уступали по влиянию на антитромботическую функцию эндотелия гепариноиду - Вессел Дуэ Ф (Рисунок 6,7,8,9). Б) А) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Индекс агрегации тромбоцитов ** # # # кт Д +В ес Э се С Д Э С л Д +Ф Ду ла эф Э ви С Д Э + Д ци С н Д + Г ио с м ес ин Э п С Д ер + К ид Э в ер и н С ц Д +М ети Э н ек С Д с + П ид ре ол Э д С Д у кт +Д а иб л ик ор ## # ** Э С Э С И Индекс дезагрегации тромбоцитов И Усл.ед. нт ак Д т +В ес Э се С Д Э С л Д +Ф Ду ла эф Э ви С Д Э + Д ци С н Д + Г ио ес см ин Э п С Д ер и +К ди н Э в ер С ц Д +М ети Э н ек С Д + П си д ре ол Э С дук Д + Д та иб л ик ор ## нт а Усл.ед. 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Примечание - обозначения, как на рисунке 6. Рисунок 8. - Влияние антиоксидантов на индекс агрегации и индекс дезагрегации тромбоцитов у животных с ЭСД Б. А. ЭСД+Пикамилон ЭСД+Нифедипин # ЭСД+Конкор ## ЭСД+Небилет ЭСД+Симвагексал ## ЭСД+Вессел Дуэф ## # ЭСД+РГПУ-147 ## ЭСД+Диротон # ЭСД+Фенибут # ЭСД+Вессел Дуэф ## ** ЭСД ** ЭСД ЭСД+РГПУ-189 Интакт Интакт 0 20 40 60 80 % 100 120 140 160 В. # # ЭСД+Дибикор # ЭСД+Гесперидин ЭСД+Мексидол # ЭСД+Кверцетин # ЭСД+Флавицин ## 20 40 60 80 % 100 120 140 ## ЭСД+Вессел Дуэф ЭСД ** Интакт 0 20 40 60 80 % 100 120 160 Примечание: ЭСД – группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; интакт - интактная группа животных; * - (P≤0,05); **(P≤0,01) достоверно по отношению к группе интактных животных; ≠ - (P≤0,05); ≠≠ (P≤0,01)достоверно по отношению к группе животных с ЭСД; (ранговый однофакторный анализ КрускалаУоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический U- критерий МаннаУитни) ЭСД+Предуктал ЭСД+Диосмин 0 140 160 Рисунок 9. Влияние изучаемых веществ на уровень фактора фон Виллебранда у животных с ЭСД При ЭСД (таблица 7,8,9) и НПГ, оценивалась вязкость крови, и соответственно влияние на этот показатель исследуемых веществ. Все 31 изучаемые соединения в той или иной мере снижали вязкость крови, однако наиболее существенное влияние среди сердечно-сосудистых средств оказал Весел Дуэ Ф, симвагексал, среди производных ГАМК - РГПУ-189, среди флавоноидов – флавицин. Таблица 7. – Влияние сердечно-сосудистых средств на вязкость крови крыс с ЭСД Группы животных Контроль-интакт ЭСД ЭСД+Вессел Дуэ Ф ЭСД +Симвагексал ЭСД+Диротон ЭСД +Небилет ЭСД + Конкор ЭСД + Нифедипин Скорость сдвига, сПз 300с-1 100с-1 3,41±0,18 4,9±0,25 4,85±0,22* 6,85±0,56* 3,8±0,21 5,1±0,44# 3,85±0,34 5,15±0,45# 3,86±0,41 5,25±0,56# 3,93±0,31 5,41±0,53 4,08±0,21 5,9±0,41 4,1±0,13 6,13±0,31 50с-1 6,4±0,38 9,51±0,71** 6,81±0,75## 7,13±0,41# 7,55±0,71 7,87±0,23 8,15±0,23 8,41±0,42 10с-1 8,54±0,55 15,48±0,6** 9,7±0,72## 10,03±0,56## 10,46±0,82# 10,75±0,73# 12,31±0,67 12,22±0,78 Примечание - ЭСД – группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; интакт интактная группа животных; * - (P≤0,05); **-(P≤0,01) достоверно по отношению к группе интактных животных; ≠ - (P≤0,05); ≠≠ (P≤0,01)- достоверно по отношению к группе животных с ЭСД; (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический U- критерий Манна-Уитни) Таблица 8. - Влияние производных ГАМК на вязкость крови крыс с ЭСД Группы животных Контроль-интакт ЭСД ЭСД +РГПУ-189 ЭСД + РГПУ-147 ЭСД + Фенибут ЭСД + Пикамилон Скорость сдвига, сПз 300с-1 100с-1 3,64±0,35 4,58±0,31 4,95±0,18* 6,72±0,34* 3,91±0,33 4,7±0,51# 4,08±0,22 4,98±0,51 4,15±0,41 5,18±0,32 4,61±0,18 6,3±0,34 50с-1 6,78±0,41 9,8±0,67* 7,11±0,31# 7,45±0,67 7,9±0,32 8,91±0,45 10с-1 8,41±0,34 15,12±0,7** 10,39±0,81## 11,4±0,65# 11,97±0,71 13,59±0,72 Примечание - обозначения, как в таблице 7. Таблица 9 – Влияние антиоксидантов на вязкость крови крыс с ЭСД Группы животных Контроль-интакт ЭСД ЭСД +Флавицин ЭСД +Кверцетин ЭСД + Мексидол ЭСД + Гесперидин ЭСД + Дибикор ЭСД + Диосмин ЭСД + Предуктал Скорость сдвига, сПз 300с-1 100с-1 3,81±0,28 4,72±0,21 4,75±0,23* 6,12±0,25* 4,02±0,23 5,1±0,14 4,2±0,18 5,61±0,23 4,25±0,18 5,78±0,34 4,31±0,14 5,91±0,33 4,44±0,14 5,98±0,31 4,4±0,19 6,02±0,34 4,56±0,19 6,0±0,31 Примечание - обозначения, как в таблице 7. 32 50с-1 6,15±0,45 9,6±0,56* 6,95±0,31# 7,15±0,3 7,44±0,31 7,56±0,52 8,1±0,38 8,31±0,56 8,79±0,56 10с-1 9,11±0,67 14,68±0,55** 10,73±0,77# 11,28±0,28# 11,39±0,71# 11,72±0,69 11,57±0,43 12,03±0,78 12,61±0,78 По степени влияния на тромбоцитарный и коагуляционный гемостаз все изучаемые вещества из исследуемых фармакологических групп можно распределить следующим образом: Вессел Дуэ Ф > Симвагексал ≥ РГПУ-189 > Диротон > Небилет > РГПУ-147≥ Флавицин > Кверцетин ≥ Конкор > Нифедипин > Мексидол > Фенибут ≥ Гесперидин ≥ Дибикор > Диосмин ≥ Предуктал > Пикамилон. Оценка влияния сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, веществ, обладающих антиокидантной активностью и флавоноидов на метаболический профиль у животных с ЭСД и НПГ. Учитывая выраженные нарушения углеводного и жирового обмена при НПГ и, особенно, при ЭСД и их важной роли в развитии ЭД, представлялось важным дать оценку влияния изучаемых веществ на метаболический профиль на фоне экспериментально вызванного сахарного диабета и недостаточностью половых гормонов, что может расширить представления о возможных механизмах эндотелиотропного эффекта исследуемых веществ (таблица 10). Таблица 10 - Влияние антиоксидантов на уровень глюкозы в крови у крыс с ЭСД (ммоль/л) День Группа Интакт ЭСД ЭСД +Флавицин ЭСД +Кверцетин ЭСД +Гесперидин ЭСД +Диосмин ЭСД +Мексидол ЭСД +Предуктал ЭСД +Дибикор 3 день 2,5±0,24 13,1±0,47** 12,87±0,29 7 день 2,81±0,19 15,55±0,64** 10,77±0,46≠≠ 14 день 2,75±0,32 16,18±0,47** 13,12±0,5≠≠ 21 день 2,6±0,28 18,14±0,56** 14,48±0,7≠≠ 30 день 2,64±0,35 19,71±0,4** 15,37±0,6≠≠ 12,42±0,6 11,87±0,65≠≠ 14,07±0,6≠ 15,52±1,16 16,2±0,62≠≠ 12,92±0,53 14,11±0,72 15,22±0,69 16,48±0,53 17±0,68≠ 12,61±0,36 14,68±0,58 15,9±0,61 16,6±0,39 17,28±0,37 13,02±0,34 14,07±0,3 15,3±0,73 16,51±0,87 17±0,74 12,42±0,7 15,08±0,75 17,21±0,4 17,01±0,9 17,65±0,61 13,12±0,53 12,47±0,51≠ 14,32±0,58≠ 15,31±0,66≠ 16,5±0,48≠≠ Примечание – обозначения, как на рисунке 7. 33 У животных с ЭСД применение соединений с антиоксидантными свойствами приводило к статистически значимому снижению сахара в крови только под влиянием флавицина, кверцетина, дибикора. Все остальные изучаемые соединения влияния на уровень гипергликемии не оказывали. Значительный гиполипидемический эффект наблюдался у симвагексала и флавицина, снижавших ИА в 2,2 и 2 раза, соответственно, а так же мексидола 1,7 раза и РГПУ-189 1,5 раза, которые превосходили по степени влияния на липидный обмен все другие исследуемые вещества. Оценка влияния изучаемых веществ на противовосполительную и антипролиферативную функции эндотелия у животных с ЭСД и НПГ. Под воздействием многих повреждающих факторов происходит изменение целостности и структуры эндотелия с нарушением практически всех его функций, в том числе противоспалительной и антипролиферативной функций (Maltais S., Perrault L. P., Ly H. Q., 2011). Под влиянием исследуемых соединений, с помощью световой микроскопии, было выявлено достоверное снижение признаков воспаления (уменьшение лейкоцитарной инфильтрации и т.д.), повышенной тромбогенности – снижение количества и размеров пристеночных тромбов и т.д. (что согласуется с данными по изучению влияния РГПУ-189, фенибута, флавицина, мексидола, Вессел Дуэ Ф на антитромботическую функцию эндотелия), отека стенки сосуда, пролиферации, соотношения комплекса интима/медиа, проницаемости сосудистой стенки, нарушения структуры эндотелиальных клеток, в большей степени в группах, получавших Вессел Дуэ Ф, РГПУ-189 и флавицин. Одним из маркеров повреждения эндотелия является количество циркулирующих эндотелиоцитов (ЦЭ) (Шумахер Г.И., 2008; Hladovec J. 1978). Исследование показало, что соединения РГПУ - 189 и флавицин статистически значимо снижают число ЦЭ (таблица 11). 34 Таблица 11. - Влияние РГПУ-189, фенибута, флавицина, мексидола и Вессел Дуэ Ф на количество циркулирующих эндотелиоцитов у животных с ЭСД и НПГ Группы Контроль-интакт ЭСД ЭСД+РГПУ189 ЭСД +Фенибут ЭСД+Флавицин ЭСД+Мексидол ЭСД+Вессел Дуэ Ф ЦЭ /100 мкл 3,2±0,85 11,3±0,74* * 4,4±0,98## 9,8±0,75 6,4±1,01## 8,8±0,75# 4,8±0,97# # Группы Контроль- ЛО НПГ НПГ+РГПУ-189 НПГ+Фенибут НПГ+Флавицин НПГ+Мексидол НПГ+Вессел Дуэ Ф ЦЭ /100 мкл 3,0±0,9 8,7±0,83* * 5,3±0,81# 7,2±1,01 6,0±0,71 # 7,5±0,61 4,3±1,01# # Примечание: ЦЭ - циркулирующие эндотелиоциты; НПГ-оперированные животные с удаленными маткой и придатками, ЛО – ложнооперированные крысы; ЭСД – животные с стрептозотацированным сахарным диабетом, Интак – интактные крысы, * - (P≤0,05); ** - (P≤0,01) достоверно по отношению к группам интактных и ЛО животных; ≠ - (P≤0,05); ≠≠ (P≤0,01)- достоверно по отношению к группе животных с ЭСД и НПГ (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический U- критерий Манна-Уитни) Кроме этого, при электронной микроскопии эндотелиальных повреждений было выявлено, что ЭСД и НПГ приводит расслоению базальной мембраны, изменению ядер эндотелиоцита по типу апоптоза, вакуолизации митохондрий с уменьшением количества митохондриальных крист. По всей видимости, такого рода нарушения связаны с активацией «внешнего апоптоза», запуск которого ассоциирован с действием свободнорадикальных процессов, активацией провоспалительных агентов (цитокинов и интерлейкинов) и т.д. (Непомнящих Л.М., и др., 2011; Ong S.-B., Hausenloy D. J., 2010). Введение изучаемых соединений РГПУ-189 и флавицина животным с ЭСД и НПГ приводило к достоверному снижению признаков апоптоза клеток эндотелиоцитов с восстановлением их ультраструктуры. Иммуногистохимический анализ влияния изучаемых веществ на уровень экспрессии e-NOS, эндотелина-1 и маркеров апоптоза:TRАIL, каспаза-3, nF-kB. На сегодняшний день известно, что в не зависимости от причины активации апоптоза, определяющую роль в его развитии занимают каспазы, образующие взаимно активирующий друг друга, разветвленный, многократно дублирующий себя каскад. В результате взаимодействия каспазного каскада активируется эффекторная каспаза 3, которая вызывает 35 расщепление внутриклеточных белков и влечет гибель клетки (Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л., 2003). Кроме этого, в запуске программы апоптоза важную роль играют расположенные на клеточной мембране специфические рецепторы TRАIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand), являющиеся важнейшим сигнальным путем запуска апоптоза различными факторами: физиологическими; агентами, вызывающими повреждение; лечебными препаратами; токсинами (этанол и др.); другими специфическими лигандами. Активация TRАIL рецепторов через ряд биохимических процессов неразрывна связана с усилением работы «доменов смерти», что в конечном счете приводит к гибели клетки (Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л., 2003). Кроме этого стоит отметить, что в основе апоптотического повреждения эндотелиоцитов при различных патологических состояниях лежит активация ядерного фактора каппа В (NFkB) – потенциалчувствительного транскрипционного фактора, регулирующего, в частности, ген экспрессии многих цитокинов, фактора роста, молекул адгезии и ферментов, включенных в процессы иммунитета и антивоспалительный ответ (H. F. Galley and N. R. Webster, 2004; Biswas S. K., Lewis C. E., 2010; Taylor C. Wallace, 2011). При выполнении блока иммуногистохимических исследований были получены следующие результаты. Стрептозотоцин индуцированный сахарный диабет, в большей степени, и экспериментально вызванная недостаточность половых гормонов, в меньшей степени, приводит к снижению экспрессии эндотелиальной NOS и увеличение экспрессии эндотелина-1, как специфических маркеров эндотелиальных нарушений (таблица 12). Кроме этого у животных с ЭСД и НПГ по сравнению с интактными животными, было отмечено достоверное увеличение экспрессии маркеров апоптоза (каспазы-3, TRАIL, NFkB) (таблица 13). 36 Таблица 12. Морфометрическая оценка экспрессии эндотелина и эндотелиальной-NOS по оптической плотности у животных с экспериментальной недостаточностью половых гормонов, сахарным диабетом и животных получавших изучаемые соединения. Эндотелиальная-NOS (Clone RN5) Оптическая плотность (единицы яркости)^ 35,9±3,5 86,3±3,2 68,7±3,7 43,7±2,5* * 79,2±3,6 34,4±2,7* * 43,7±2,1## 76,3±2,8## 50,2±2,6# 69,4±2,4# # 51,9±3,6 54,0±3,5# 52,0±2,4# 58,3±2,3# # 49,1±2,7 60,1±3,2# 50,2±1,9# 62,8±3,1# 50,4±1,8# 67,9±2,3## ## 45,7±4,4 74,4±2,4## 60,6±2,1 54,8±1,8 59,8±2,8 50,3±1,3 Эндотелин (Clone RJT) Контроль интактные НПГ СД НПГ+Вессел Дуэ Ф СД+Вессел Дуэ Ф НПГ+РГПУ189 СД+ РГПУ189 НПГ+Мексидол СД+Мексидол НПГ+Флавицин СД+Флавицин НПГ+Фенибут СД+Фенибут Примечание: ^- оптическую плотность рассчитывали с помощью программы морфометрического анализа изображений ВидеоТест-Морфо 4.0 (Россия). НПГ-оперированные животные с удаленными маткой и придатками, ЭСД – животные с стрептозотацированным сахарным диабетом, Интак – интактные крысы; * р<0,05; * * - р<0,01-достоверно по отношению к группе интактных животных; # - р<0,05; ##- р<0,01 достоверно по отношению к группам животных с недостаточностью половых гормонов и сахарным диабетом (критерий Уайта-Вилкоксона) Таблица 13. Иммуногистохимические характеристики эндотелиоцитов по Allred D.C. et al. (1998). Интенсивность экспрессии Интакт ЭСД Флавиц РГПУ Каспаза 3 TRAIL nF-kB + + + +++ +++ +++ ин -189 + ++ ++ ++ ++ + Количество клеток Интакт ЭСД Флавицин + + + +++ ++ ++ + + + РГПУ189 + + + Примечание: ЭСД – животные с стрептозотацированным сахарным диабетом, Интак – интактные крысы Представленные в таблице данные о влиянии соединения РГПУ-189 и флавицина и свидетельствующие об увеличении концентрации e-NOS и снижении уровня эндотелина, обьясняют их эндотелиопротекторное действие. Кроме этого, в ходе работы было отмечено, что РГПУ-189 и флавицин достоверно снижали уровень экспрессии каспазы-3, TRАIL и NFkB у животных со стрептозотоцин индуцированным сахарным диабетом (таблица 13,14), что может лежать в основе их антиапоптопического действия. 37 Таблица 14. Индекс апоптоза эндотелиоцитов. Группы Интактная ЭСД РГПУ-189 Флавицин Апоптотический индекс % 3,6±0,2 36,2±2,9* * 14,3±1,2## 19,25±1,9# Примечание: ЭСД – животные с стрептозотацированным сахарным диабетом, Интак – интактные крысы* р<0,05; * * - р<0,01-достоверно по отношению к группе интактных животных; # - р<0,05; ##- р<0,01 достоверно по отношению к группам животных с недостаточностью половых гормонов и сахарным диабетом (критерий Уайта-Вилкоксона) Следует отметить, что полученные в при электронной микроскопии данные и в связи с ними выдвинутые ранее предположения о прямом влиянии изучаемых веществ РГПУ-189 и флавицина на систему синтеза эндогенного оксида азота и снижении процессов апоптоза полностью подтвердили результаты имуногистохимического исследования. Таким образом, соединение РГПУ- 189 и флавицин у животных с ЭСД и НПГ вызывают улучшение вазодилатирующей, антитромботической, антипролиферативной, противовосполительной функций эндотелия. В основе высокой эндотелиопротекторной активности соединения РГПУ-189 и флавицина по всей видимости лежит снижение апоптоза (каспазы-3, TRAIL, NF-kB), увеличении активности e-NOS и снижении экспрессии эндотелина-1. ВЫВОДЫ: 1. При экспериментальном сахарном диабете (ЭСД) и недостаточности половых гормонов (НПГ) отмечается выраженная эндотелиальная дисфункция (ЭД), что проявляется в снижении вазодилатирующей в 2,5 и 1,7 раза, соответственно, антитромботической в 1,7 и 1,3 раза, противовоспалительной функций в 2,2 и 1,5 раза, и увеличение количества циркулирующих эндотелиоцитов в 3,5 раза и 2,9 раза. При операционной травме также наблюдается выраженная эндотелиальная дисфункция, однако она носит относительно кратковременный, обратимый характер и через трое – четверо суток нормальная функция восстанавливается. Полученные результаты позволяют рекомендовать ЭСД и НПГ для моделирования эндотелиальной дисфункции в эксперименте. 38 2. При проведении тестирования вазодилатирующей функции эндотелия различных сосудистых регионов (мозг, печень, почка и кожномышечная область), выявлен однонаправленный ответ сосудов. Наибольшая вазодилатирующая реакция наблюдалась в сосудах печени и мозга, в меньшей степени в почке и кожно мышечной области. Результаты исследования позволяют экстраполировать полученные в ходе эксперимента данные по изменению функции эндотелия в одной сосудистой области и на другие сосуды с разным типом эндотелия. 3. Разработанный комплексный морфо-функциональный подход изучения эндотелиальной функции/дисфункции может применяться для оценки вазодилатирующей, антитромботической, противовоспалительной, антипролиферативной функций эндотелия, позволяет оценить мощность функционирования NO системы и выраженность ЭД, а также эндотелиопротективное действие изучаемых веществ. 4. По степени улучшения вазодилатирующей функции эндотелия под влиянием исследуемых соединений их можно расположить следующим образом: Вессел Дуэ Ф > Диротон ≥ Симвагексал ≥ Небилет > РГПУ-189 > Флавицин ≥ РГПУ-147 > Кверцетин ≥ Мексидол > Конкор > Гесперидин > Диосмин > Предуктал > Пикамилон > Нифедипин ≥ Фенибут ≥ Дибикор. 5. По степени улучшения антитромботической функции эндотелия под влиянием изучаемых соединений их можно расставить в следующем порядке: Вессел Дуэ Ф ≥ Симвагексал ≥ РГПУ-189 > Диротон > Небилет > РГПУ-147≥ Флавицин > Кверцетин ≥ Конкор > Нифедипин > Мексидол > Фенибут ≥ Гесперидин ≥ Дибикор > Диосмин ≥ Предуктал > Пикамилон. 6. Новое производное ГАМК - РГПУ-189 и флавицин выражено улучшают противовоспалительную и антипролиферативную функции эндотелия, что проявляется в снижении уровня С-реактивного белка, уменьшении морфологических признаков воспаления, уменьшении соотношения интима/медиа, пролиферации и проницаемости сосудистой 39 стенки, восстановлении структуры эндотелиоцитов, снижении их десквамации, апоптоза и некроза у животных с ЭСД и НПГ. 7. Исследуемые производные ГАМК - соединения РГПУ-189 и РГПУ147 и флавоноиды уменьшают гиперхолестеринемию, индекс атерогенности у животных с ЭСД и НПГ. Флавицин и в меньшей степени другие исследуемые флавоноиды снижают гипергликемию. 8. Соединения РГПУ-189 и флавицин вызывают угнетение экспрессии маркеров апоптоза (TRAIL, каспаза-3, NF-kB), снижение экспрессии эндотелина-1 и усиление активности е-NOS, что очевидно лежит в основе их эндотелиопротекторного действия. 9. Из всех исследуемых веществ Вессел Дуэ Ф оказал наиболее выраженное эндотелиопротекторное действие, что позволяет рекомендовать его в качестве эталонного препарата сравнения при сопоставлении эндотелиотропных эффектов различных исследуемых веществ. Практические рекомендации. Разработанный комплексный морфо-функциональный подход может применяться для оценки антитромботической, степени ЭД (вазодилатирующей, противовоспалительной, антипролиферативной функций эндотелия), мощности функционирования NO системы, а также дает возможность оценить эндотелиотропные свойства исследуемых веществ. Проведенный сравнительный анализ полученных данных о влиянии известных сердечно-сосудистых средств, флавоноидов, веществ, обладающих антиоксидантной активностью, и производных ГАМК и гепариноида на эндотелиальную дисфункцию в условиях гормональных нарушений различного генеза позволил выявить соединения с высокой эндотелиопротективной симваГЕКСАЛ, активностью: небилет, мексидол, Весcел которые Дуэ могут Ф, диротон, применяться в комплексной терапии ЭД при ассоциированных с нею сердечно-сосудистых заболеваниях, а также для профилактики и лечения сосудистых осложнений, связанных с СД и НПГ. Полученные данные 40 свидетельствуют о перспективности дальнейшего изучения соединения РГПУ-189 и флавицина, для создания на их базе новых препаратов с эндотелиопротекторной активностью. Полученные в ходе работы результаты также позволяют рекомендовать проведение целенаправленного поиска высоко эффективных эндотелиопротекторов среди производных ГАМК и флавоноидов. Список опубликованных работ по теме диссертации: Статьи, опубликованные в научных журналах и изданиях рекомендованных ВАКРФ 1. Тюренков, И.Н. Влияние нового производного фенибута на церебральное кровообращение в условиях модификации синтеза оксида азота на фоне ишемии мозга / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, М.Н. Багметов, Л.Е. Бородкина // ж. «Регионарное кровообращение и микроциркуляция».-2005.-Т.4.-№1(18).-С.139-141. 2. Тюренков, И.Н. Сравнительная оценка нейропротекторного действия фенибута и пирацетама в условиях экспериментальной ишемии мозга у крыс / И.Н. Тюренков, М.Н. Багметов, В.В. Епишина, Л.Е. Бородкина, А.В. Воронков // ж. «Экспериментальная и клин. фармакология».-М.-2006.-С.19-22. 3. Тюренков, И.Н. Влияние гесперидина и флавицина на печеночный кровоток в норме и условиях активации и блокады синтеза эндогенного оксида азота / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, Е.Г. Доркина // ж. «Регионарное кровообращение и микроциркуляция».-СПб.-2006.-Т.5.-№3(13).-С.84-87. 4. Воронков А.В. Изменение кровотока в различных сосудистых регионах при стимуляции и блокаде синтеза эндогенного оксида азота / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков // ж. «Регионарное кровообращение и микроциркуляция».-СПб.-2006.-Т.5.№3(19).-С.93-95. 5. Тюренков, И.Н. Допплерографическое изучение эндотелиальной дисфункции церебральных сосудов крыс при недостаточности половых гормонов / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.И. Робертус, С.А. Воскресенский, Д.В. Куркин // Региональное кровообращение и микроциркуляция.-2007.-Т.6.-№1(21).-С.175-176. 6. Тюренков, И.Н. Методический подход к оценке эндотелиальной дисфункции в эксперименте / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков // Экспериментальная и клиническая фармакология.-2008.-Т.71.-№1.-С.49-51. 7. Воробьев, А.А. Послеоперационная функциональная дисрегуляция брюшины и ее морфологический субстрат / А.А. Воробьев, С.В. Поройский, И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, В.Б. Барканов, Б.Б. Полуосьмак // Вестник ВолГМУ.-2008.-№3.-С.34-37. 8. Воронков, А.В. Изучение «L-аргининового парадокcа» для оценки эндотелиальной функции в норме и патологии / А.В. Воронков, А.И. Робертус, И.Н. Тюренков // Региональное кровообращение и микроциркуляция. .-2008.-Т.7.-№3(27).С.54-58. 9. Тюренков, И.Н. Использование многократного введения ацетилхолина для оценки эндотелиальной функции и возможной стабильности системы синтеза оксида азота / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.И. Робертус // Региональное кровообращение и микроциркуляция.-2009.-Т.8.-№1(29).-С.50-53. 10. Тюренков, И.Н. Изучение дисфункции эндотелия у животных с экспериментально вызванной недостаточностью половых гормонов / И.Н. Тюренков, А.В.Воронков, А.И. Робертус // Кардиология.-2009.-№5.-С.64 – 65. 11. Тюренков, И.Н. Недостаточность половых гормонов. Эндотелиальная функция и ее коррекция эстрогенами / И.Н. Тюренков, А.В.Воронков, А.И. Робертус // Экспериментальная и клиническая фармакология.- 2009.-Т.72.-№6.-С.57-59. 41 12. Тюренков, И.Н. Развитие эндотелиальной дисфункции при недостаточности половых гормонов // И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.И. Робертус //Патологическая физиология и экспериментальная теpапия.-2009.-№4.-С.33-36. 13. Тюренков, И.Н. Зависимость между антиоксидантным действием флавоноидов и их влиянием на вазодилатирующую функцию эндотелия в условиях эндотелиальной дисфункции / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, Е.В. Петрова, Е.Г. Доркина // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2010. - Т. 73,№10. – С.14-17. 14. Тюренков, И.Н. Влияние флавицина на вазодилатирующую и антитромботическую функции эндотелия у животных с экспериментальным сахарным диабетом / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, Е.В. Петрова, А.А. Слиецанс, Э.Т. Оганесян // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2010. - Т. 73,№12. – С.17-20. 15. Тюренков, И.Н. Сравнительная оценка влияния небиволола и бисопролола на вазодилатурующую и антитромботическую функции эндотелия мозговых сосудов у животных с сахарным диабетом / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков // Вестник новых медицинских технологий.-Тула.-2010.- №4(36).-С.152-155. 16. Тюренков, И.Н. Влияние лизиноприла на вазидилатирующую и антитромбическую функции эндотелия при сахарном диабете / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков // ж. «Врач».-2011.-№2.-С.35-37. 17. Тюренков, И.Н. Морфологические и функциональные критерии оценки эндотелиальной дисфункции сосудов головного мозга крыс при гормональных патологиях различного генеза / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, Г.Л. Снигур, С.В. Поройский, А.А. Слиецанс, А.И. Робертус // Вестник новых медицинских технологий.-Тула.-2011.- №1.-С.197-200. 18. Тюренков, И.Н. Влияние симвастатина на эндотелийзависимую вазодилатацию мозговых сосудов у животных со стрептозотацин-индуцированным сахарным диабетом / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков // Вестник ВолГМУ.-2010.-№4. – С.87-90. 19. Воронков, А.В. Коррекция эндотелиальной дисфункции, вызванная экспериментальным сахарным диабетом соединениями с антиоксидантным действием / А.В. Воронков, И.Н. Тюренков, А.А. Слиецанс // Региональное кровообращение и микроциркуляция.-2011.-в печати. 20. Тюренков, И.Н. Сравнительная оценка вазодилатирующей функции эндотелия при патологиях различного генеза / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, Е.В. Петрова, А.А. Слиецанс, А.И. Робертус, Е.В. Волотова // Региональное кровообращение и микроциркуляция.-2011.-в печати. 21. Воронков, А.В. Влияние сердечно-сосудистых средств на вазодилатирующую функцию животных с экспериментальной недостаточностью половых гормонов /А.В. Воронков, И.Н. Тюренков // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2011. - в печати. Статьи, опубликованные в научных сборниках и журналах: 1. Воронков, А.В. Эффективность влияния мефебута на скорость церебрального кровотока по результатам доплерографического исследования у крыс с острой ишемической патологией головного мозга / А.В. Воронков, И.Н. Тюренков, Л.Е. Бородкина, М.Н. Багметов, В.В. Епишина // Материалы научной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины», Паттайя, (Тайланд), ж. «Успехи современного естествознания», Москва «Академия естествознания».-2004.-№12.-С.41. 2. Тюренков, И.Н. Защитное действие фенильных производных кислоты гаммааминомасляной в условиях тотальной и региональной ишемии / И.Н. Тюренков, Л.Е. 42 Бородкина, В.Н. Перфилова, А.В. Воронков // «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции». Сборник научных трудов (Пятигорская государственная фармацевтическая академия), Вып. 60.-Пятигорск.-2005.-С.429-431. 3. Воронков А.В. Влияние блокады и активации синтеза эндогенного оксида азота на мозговой и печеночный кровоток / А.В. Воронков, Л.Е. Бородкина // Материалы научной конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии», Тунис, ж. «Фундаментальные исследования», Москва «Академия Естествознания».-2005.-№5.-С.44. 4. Тюренков, И.Н. Влияние активации и блокады выработки нитрооксида на кровообращение мозга, печени, почек и костно-мышечной области / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков // 13-ый Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Сборник материалов конгресса.-Москва.-2006.-С.307. 5. Воронков, А.В. Влияние недостаточности половых гормонов на структуру эндотелия сосудов почек у крыс обоего пола / А.В. Воронков, И.Н. Тюренков, Г.Л. Снегур // Бюллютень Волгоградского научного центра РАМН.-Волгоград.-2006.-С.13-15. 6. Тюренков, И.Н. Изучение скорости локального мозгового кровотока с модификацией синтеза эндогенного оксида азота на фоне недостаточности половых гормонов у крыс обоего пола/ Тюренков И.Н., Воронков А.В., РобертусА.И.,. Воскресенский С.А,.Куркин Д.В, Слиецанс А.А., Драгилев Г.В. // Научные труды VII международной научнопрактической конференции «Здоровье и образование в XXI веке», – Москва, 2006. – С. 510-511. 7. Воронков, А.В. Влияние нового производного ГАМК на мозговой кровоток в условиях подавления и усиления синтеза эндогенного оксида азота на фоне ишемии мозга/ А.В. Воронков, А.И. Робертус, С.А. Воскресенский, Д.В. Куркин // Сборник трудов III Международной медико-фармацевтической конференции студентов и молодых ученых Черновцы.- Украина.- 2006.-С.115. 8. Тюренков, И.Н. Оценка эндотелиальной дисфункции методом высокочастотной допплерографии для профилактики послеоперационных нарушений микроциркуляции и тромбоэмболических осложнений / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.А. Воробьев, С.В. Поройский // Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. Сердечно сосудистые заболевания.-Москва.-2007.-Т.8.-№6.-С.348. 9. Воробьев, А.А. Использование высокочастотной допплерографии для оценки эндотелиальной функции и рисков спаечной болезни у больных сахарным диабетом в полеоперационном периоде (экспериментальное исследование) / А.А. Воробьев, С.В. Поройский, И.Н. Тюренков, А.В. Воронков // Симпозиум «Регионарное кровообращение и микроциркуляция в клинической практике», на базе Всероссийского съезда хирургов НЦССХ им. Бакулева, 2007.-С.351. 10. Тюренков, И.Н. Оценка эндотелиальной дисфункции методом высокочастотной допплерографии для профилактики послеоперационных нарушений микроциркуляции и тромбоэмболических осложнений / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.А. Воробьев, С.В. Поройский // Бюллетень НЦССХ им.А.Н, Бакулева РАМН. Сердечно сосудистые заболевания-2007.-Т.8.-№6.-С.348. 11. Тюренков, И.Н. Влияние овариэктомии на мнестические и когнетивные процессы животных с оценкой эндотелиальной функции церебральных сосудов кастрированных крыс / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.И. Робертус, Д.В. Куркин, С.А. Воскресенский, А.А. Слиецанс // Научные труды VIII международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации», РУДН.-Москва.-2007.С.639-640. 12. Тюренков, И.Н. Фармакологическая коррекция эндотелиальной дисфункции, вызванной гормональной недостаточностью / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.И. Робертус // Психофармакология и биологическая наркология: материалы III съезда 43 фармакологов России, Фармакология- практическому здравоохранению.-СанктПетербург.-2007.-Т.7.-Спец.вып., часть 2.-С.2-1983. 13. Тюренков, И.Н. Морфологическая оценка эндотелия сосудов почек после ампутации матки с придатками / И.Н. Тюренков, А.А. Воробьев, А.В. Воронков, С.В. Поройский, В.Б Барканов // Международная конференция «Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза в норме и при воздействии антропогенных факторов. Экология и здоровье человека» Астрахань.-2007.-№2.-С.-187-188. 14. Тюренков, И.Н. Изучение влияния биофлавоноидов на печеночную микроциркуляцию в условиях нормы и модификации синтеза эндогенного оксида азота (NO) / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.И. Робертус // Сборник материалов и тезисов: VI Международная конференция «Гемореология и микроциркуляция» (от молекулярных мишеней к органным и системным изменениям).-Ярославль.-2007.-С.193. 15. Тюренков, И.Н. Влияние нового производного ГАМК на эндотелиальную дисфункцию при ишемии головного мозга / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.И. Робертус, С.А. Воскресенский, Д.В. Куркин, А.А. Слиецанс // Материалы 14-ого Российского национального конгресса «Человек и лекарство». 18-22 апреля 2007.Москва.-2007.-С.632. 16. Тюренков, И.Н. Влияние гесперидина на церебральный кровоток животных, подвергшихся овариоэктомии на фоне модификации синтеза эндогенного оксида азота / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, Е.Г. Доркина // Материалы II международная научная конференция «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений».Алматы.-Казахстан.-2007.-С.107-108. 17. Воробьев, А.А. Изменения микроциркуляции брюшины в динамике экспериментальной операционной травмы / А.А. Воробьев, С.В. Поройский, И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, В.Б. Барканов // Международная дистанционная научнопрактическая конференция, посвященная памяти выдающегося ученого и хирурга профессора Василия Николаевича Парина. Внедрение инновационных технологий в хирургическую практику (фундаментальные и прикладные аспекты).-Пермь.-2008.-7072. 18. Тюренков, И.Н. Изучение скорости кровотока у животных с экспериментальным сахарным диабетом в условиях тромбообразования и модификации синтеза эндогенного NO / И.Н. Тюренков, Воронков А.В., Заитениди И.К., Робертус А.И., Воскресенский С.А., Слиецанс А.А. // IX Международный конгресс молодых ученых «Науки о человеке»: материалы…- Томск, 2008. - С.108-109. 19. Тюренков, И.Н. Морфологические изменения эндотелиоцитов мозга крыс с экспериментально вызванной недостаточностью половых гормонов / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.И. Робертус, А.А. Воробьев, С.В. Поройский, А.В. Поройская // Человек и лекарство: тезисы докладов 15-го Российского национального конгресса. – Москва, 2008. – С. 421. 20. Тюренков, И.Н. Диагностика эндотелиальной функции в эксперименте / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.И. Робертус, И.К. Заитениди, С.А. Воскресенский // Ангиология и сосудистая хирургия.-2008.-Т.14.-№3.-Приложение.-С.155-156. 21. Тюренков, И.Н. Основные методические приемы изучения эндотелиальной функции в эксперименте / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.И. Робертус, А.А. Воробьев, С.В. Поройский // Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН сердечно-сосудистых заболеваний. Приложение №1: тезисы докладов и сообщений XIV Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов.-Москва.-2008.-Т.9.-№6.-С.156. 22. Воробьев, А.А. Состояние микроциркуляции сосудов брюшины в динамике операционной травмы / А.А. Воробьев, И.Н. Тюренков, С.В. Поройский, А.В. Воронков /// Бюллетень ВМЦ РАМН.-2008.-№1.-С.50-53. 23. Тюренков, И.Н. Основные методические приемы изучения эндотелиальной функции в эксперименте / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.И. Робертус, А.А. Воробьев, С.В. 44 Поройский // Четвертая всероссийская конференция «Клиническая гемостезиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием).-Москва.2009.-С.188-189. 24. Воронков, А.В. Определение десквамированных эндотелиоцитов в крови крыс с недостаточностью половых гормонов / А.В. Воронков, И.Н. Тюренков, А.И. Робертус, А.А. Слиецанс, Д.В. Куркин // Человек и лекарство: тезисы докладов 16-го Российского национал. конгресса 2009г. – Москва, 2009. – С.635. 25. Тюренков, И.Н. Недостаточность половых гормонов, эндотелиальная дисфункция и коррекция ее ГАМК-ергическими средствами / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.И. Робертус, Е.В. Петрова // Материалы VIII Съезда кардиологов ЮФО.- Ростов-на-Дону.2009.-С.201-202. 26. Робертус, А.И. Оценка взаимосвязи между уровнем фибриногена и скоростью тромбообразования у животных с недостаточностью половых гормонов на фоне введения производного ГАМК РГПУ-189 / А.И. Робертус, А.В. Воронков // Сборник трудов межвузовской научной конференции, посвященной памяти профессора Владислава Васильевича Пичугина и 75-летию КГМУ. «Актуальные вопросы фармакологии и фармации» 400с .-Курск.-2009.-С.308-309. 27. Тюренков, И.Н. Эндотелиопротективное действие структурных аналогов ГАМК / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.И. Робертус, А.А. Слиецанс, Е.В. Петрова, Д.В. Куркин // Сборник научных трудов (под редакцией академика РАМН В.И.Петрова) 56ой региональной научно-практической конференции профессорско-преподавательского коллектива ВолГМУ: Инновационные достижения фундаментальных и прикладных мед.исследований в развитии здравоохранения Волгоградской обл.-Издательство ВолГМУ.-Волгоград.-2009.- С.289-291. 28. Слиецанс, А.А. Изучение антитромботической активности флавицина у животных с экспериментальным сахарным диабетом / А.А. Слиецанс, И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, Е.В. Петрова // Научная конференция “Актуальные вопросы фармакологии и фармации”: сб.науч.тр. - Курск, 2009. – С. 322-323. 29. Слиецанс, А.А. Влияние дибикора на уровень липопротеидов высокой плотности и общий холестерин у крыс при экспериментальном сахарном диабете / А.А. Слиецанс, А.В. Воронков, Е.В. Петрова // X Международный конгресс “Здоровье и образование в XXI веке РУДН ”: сб.науч.тр. - Москва, 2009. - С. 845. 30. Тюренков, И.Н. Эндотелиальная дисфункция при экспериментальном сахарном диабете и возможность ее коррекции флавоноидами / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.А. Слиецанс, Е.Г. Доркина // VIII съезд кардиологов Южного Федерального округа «Совершенствование оказания медицинской помощи больным с сердечно-сосудистыми заболеваниями – новые подходы и перспективы»: материалы… - Ростов-на-Дону, 2009. С. 199-200. 31. Тюренков, И.Н. Изучение влияния гесперидина на эндотелиальную функцию животных с экспериментально вызванным сахарным диабетом / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, Е.Г. Доркина, А.А. Слиецанс // Бюллетень Волгоградского научного центра РАМН. – 2009. - №1. - С. 19-21. 32. Тюренков, И.Н. Влияние мексидола на эндотелиальную функцию церебральных сосудов у животных с экспериментальным сахарным диабетом / И.Н. Тюренков, А.В.Воронков, А.А. Слиецанс, Е.В.Петрова // X Международный конгресс “Здоровье и образование в XXI веке РУДН ”: сб.науч.тр. - Москва, 2009. - С. 797-798. 33. Тюренков, И.Н. Оценка функционального состояния эндотелия по изменению сосудистой вазодилатации и показателям свертываемости крови у животных с экспериментальным сахарным диабетом / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, Е.В. Петрова, А.А. Слиецанс // Научная конференция “Актуальные вопросы фармакологии и фармации”: сб.науч.тр. - Курск, 2009. – С.336-338. 45 34. Поройский, С.В. Послеоперационные микроциркуляторные нарушения брюшины и способы их фармакологической коррекции / С.В. Поройский, А.А. Воробьев, И.Н. Тюренков, А.В. Воронков // Четвертая всероссийская конференция «Клиническая гемостезиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием).-Москва.-2009.-С.160-161. 35. Тюренков, И.Н. Вещества с эндотелиопротективными свойствами новое направление в создании сердечно-сосудистых средств / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков // Материалы 8 съезда кардиологов Южного Федерального округа «Совершенствование оказания медицинской помощи больным с сердечно-сосудистыми заболеваниями – новые подходы и перспективы».-Ростов-на-Дону.-2009.-С.198-199. 36. Слиецанс, А.А. Изучение антитромботической активности диосмина как компонента его эндотелиопротективного действия у животных с экспериментальным сахарным диабетом / А.А. Слиецанс, Е.В. Петрова, А.В. Воронков, А.И. Робертус // II Всероссийский научно-практический семинар для молодых ученых “Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии”: материалы… – Волгоград, 2010. - С. 108-109. 37. Слиецанс, А.А. Изучение влияния гесперидина на вазодилатирующую функцию церебральных сосудов у животных с эндотелиальной дисфункцией на фоне экспериментального сахарного диабета / А.А. Слиецанс, А.В. Воронков, Е.В. Петрова // V Международная (XIV Всероссийская) Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых: материалы... - Москва, 2010 г.- С. 552. 38. Тюренков, И.Н. Морфологическая оценка эндотелиальной дисфункции, в сосудах почек крыс обоего пола, с экспериментально вызванной недостаточностью половых гормонов / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, Г.Л. Снигур, С.В. Поройский, А.В. Поройская, А.И. Робертус, А.А. Слиецанс, Е.В. Петрова // Сборник трудов научнопрактической конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии» посвященной памяти член корр. РАМН, з.д.н. РФ, д.м.н., проф. В.Б.Писарева.- Волгоград.-2010.-С.145-149. 39. Робертус, А.И. Изучение антитромботической активности производного ГАМК РГПУ-189 в условиях эндотелиальной дисфункции при экспериментально вызванной недостаточностью половых гормонов / А.И. Робертус, А.В. Воронков // Вестник РГМУ. Периодический медицинский журнал. – М.: ГОУ ВПОРГМУ Росздрава. – 2010, Специальный выпуск № 2. –С.542. В ходе работы получен: Патент Российской Федерации на изобретение №2374699. зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 ноября 2009 года. АЦХ – ацетилхолин Список сокращений НТГ - нитроглицерин АЧТВ – активированное частичное ЭД - эндотелиальная дисфункция ЭСД – экспериментальный сахарный тромбопластиновое время ПВ – протромбиновое время диабет НПГ – недостаточность половых ТВ – тромбиновое время СРБ – С-реактивный белок гормонов ЭЗВД эндотелиозависимая ОС-оксидативный стресс СК-скорость мозгового кровотока вазодилатация ЭНЗВД эндотелионезависимая вазодилатация 46 ЭНДОТЕЛИАЛЬНАЯ ДИСФУНКЦИЯ И ПУТИ ЕЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ Воронков Андрей Владиславович АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Подписано к печати «_____»____________2011 г. Формат бумаги 60x84 1/16 Бумага кн.-журнальная. Печать ротапринтная. Волгоградский государственный медицинский университет Усл. печ. л. 1,0. Тираж 200 экз. Заказ №_____ Государственное профессионального общеобразовательное образования учреждение «Волгоградский высшего государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской федерации», 400131, г. Волгоград, Пл. Павших Борцов, 1. 47
