НТО КЭ Област - Координационный научно

Научно-техническое обоснованеие
космического эксперимента „Област”
1. Сущность исследовательской проблемы. Краткая история и состояние вопроса.
Исследования на космических спутниках и станциях, в том числе проведенные нами совместно со
специалистами России (Институт медико-биологических проблем, Москва), Нидерландов на
биоспутниках “БИОН” и американской космической лаборатории “SLS-2”, показали, что костный
скелет является одной из важнейших мишеней действия микрогравитации на организм.
Установлено, что в этих условиях происходит уменьшение массы кости, прочности и минеральной
насыщенности скелета, снижение интенсивности остеопластических и усиление резорбтивных
процессов, особенно в костях, несущих опорную нагрузку. Потеря костной массы
квалифицируется как клинически значимая остеопения (иногда остеопороз) (Morey-Holton et al.,
1981; Газенко и соавт., 1986; Григорьев и соавт., 1994; Oganov V.S., 2006; Оганов В.С., Бакулин и
др., 2005; Родионова Н.В., 1989, 2006; Rodionova N.V., Oganov V.S, 2009 и др.). Это является
серьёзным фактором, лимитирующим длительность космических полётов. Остеопороз,
обусловленный малоподвижным способом жизни (гипокинезия), в настоящее время
рассматривается как «болезнь цивилизации». Несмотря на существующие разработки (Garetto et
al., 1992; Григорьев А.И., Воложин А.И., 1994; Rodionova N.V., Oganov V.S., 2001; Родионова
Н.В., Оганов В.С, 2001; Rodionova N.V., Oganov V.S., Zolotova N.V., 2002), остаются во многом не
выясненными клеточные и тканевые механизмы развития, пролиферации и динамики
дифференцировки остеогенных клеток в условиях снижения гравитационной нагрузки.
Экспериментальными исследованиями показано, что в составе клеток стромы костного мозга,
создающих регуляторное микроокружение для гемопоэтических клеток, имеется популяция
мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (МСК), способных к самообновлению и
дифференцировке в фибробласты, ретикулоэндотелиальные клетки, остеогенные клетки,
адипоциты в зависимости от локальных и системных факторов. Впервые МСК были выделены и
описаны A.J. Fridenstein и сотрудниками (Fridenstein A.J., et al., 1978).
С применением электронно-микроскопической радиографии с предшественником ДНК 3Нтимидином в развивающейся строме костного мозга in vivo нами (Родионова Н.В., 1989, 2006;
Rodionova N.V., Oganov V.S., 2003;) описаны недифференцированные с характерной
ультраструктурой интенсивно пролиферирующие и самообновляющиеся стромальные клетки. В
зрелой строме костного мозга основная часть популяции этих клеток не включает 3Н-тимидин и
находится в фазе Go клеточного цикла. Такие клетки имеют периваскулярную локализацию или
связаны с сосудами отростками. Мы полагаем, что они представляют собой субпопуляцию клеток,
способных к колониеобразованию в опытах in vitro и могут рассматриваться как претенденты на
роль мультипотентных МСК.
Стволовые клетки содержат репрессированные группы генов, способные к активации, которые
определяют специфические синтезы для цитодифференцировки в нескольких направлениях. При
переходе стволовых клеток в полустволовые (комитированные) активной становится лишь группа
генов, которые определяют синтезы, специфичные только для одного направления
цитодифференцировки. В частности, дифференцировка остеогенных клеток связана со снижением
транскрипции генов, которые кодируют белки, участвующие в пролиферации, адгезии и
повышении транскрипции генов остеобласт-специфических белков. Для зрелых остеобластов
характерен синтез преимущественно коллагена І типа, костных морфогенетических белков (КМБ),
факторов роста β (ТФРβ), а также фермента щелочной фосфатазы и др (Воложин А.И., Оганов
В.С., 2005).
Электронно-микроскопические исследования, в т.ч. проведенные нами (Родионова, 2006;
Родионова Н.В., Оганов В.С., Бабак С.В., 2008), показали, что стромальные клетки (МСК),
остеогенные клетки-предшественники, остеобласты и остеоциты при помощи отростков
формируют стромально-остеоцитарный синцитий, структуру, обеспечивающую в костной ткани
трансдукцию механических сигналов. Получены экспериментальные данные (Noble et al., 2003 и
др.), что остеоциты первыми воспринимают изменения гравитационного поля и передают
механические сигналы по стромально-остеоцитарной сети, и тем самым адаптируют
(ремоделируют) остеогенетические и остеопластические процессы в костных структурах. Реакции
МКС и их производных in vivo в системе остеоцит – клетки стромы в условиях космического
полёта не изучены. Поэтому для раскрытия механизмов гравичувствительности клеток костной
ткани актуальным является исследование стромальных клеток костного мозга in vitro при
отсутствии остеоцитарных механических стимулов и системных факторов в условиях
микрогравитации.
Эксперименты на клеточных культурах с использованием различных методических подходов и
маркеров специфических биосинтезов, проведенные на биоспутниках и в наземных условиях
выявили, что остеогенные клетки гравичувствительны, показана тенденция к снижению
дифференцировочных потенций клеток стромы костного мозга (Березовская, Родионова Н.В. 1998;
Родионова Н.В., Богданович, 2005; Buravkova L. et al., 2005). Условия экспериментов и
методические подходы различны, поэтому имеющиеся сведения во многом противоречивы. Так
остаётся неясным – снижается пролиферативная активность мультипотентных МСК или
происходит замедление дифференцировки остеогенных клеток-предшественников, имеет ли место
изменение соотношения количества клеток различных направлений дифференцировки
(остеогенных, адипоцитов, фибробластов). Ответы на эти вопросы важны для понимания, какие
механизмы (перестройки) лежат в основе нарушений остеогенетических и остеопластических
процессов, приводящие к развитию остеопенических явлений при микрогравитации.
Планируемый космический эксперимент предусматривает с помощью комплекса современных
методов исследования изучение в клеточных культурах стромы костного мозга, включающих
остеогенные клетки-предшественники особенностей колониеобразования, цитологических и
морфологических характеристик, пролиферативной активности, адгезивных свойств,
направленности дифференциации, специфического функционирования, межклеточных контактов
и т.д. Для выяснения механизмов гравитационно-зависимых реакций клеток стромы костного
мозга необходимым является электронно-микроскопическое изучение состояния клеток: ядра и
клеточных органелл (эндоплазматической сети, комплекса Гольджи, митохондрий, лизосомного
аппарата, полисом, а также цитоскелета). Цитоскелет, как уже установлено в ряде исследований
(Rodionova N.V., Shevel I.M. и др. 2000; Гершович и соавт., 2009 и др.) играет ведущую роль в
механорецепции и механочувствительных реакциях клеток. Изучению изменений в
ультраструктуре клеток стромы при микрогравитации будет уделено особое внимание, так как
анализ научной литературы показал, что такие исследования малочисленны и малоинформативны.
2
Имеющийся у постановщика эксперимента «Област» опыт исследования остеогенных клеток в
условиях КЭ, а также в наземных условиях позволяет обеспечить эффективную реализацию
эксперимента.
2.Необходимость проведения КЭ в условиях космического пространства в составе РС МКС.
Российский сегмент МКС (РС МКС) позволяет в полном объёме решить научные задачи
космического эксперимента «ОБЛАСТ» с использованием установки «Биолаборатория М».
3.Описание КЭ
3.1 Порядок проведения КЭ
Перед стартом клеточные культуры костного мозга крыс, находящиеся в биоконтейнерах,
выдерживаются в термостате при температуре +37°С в течение 3 суток для адгезии клеток. После
этого биоконтейнеры с культурами размещаются транспортировочном устройстве
«Биолаборатории М» и доставляются на борт станции при температуре + 4°С. Активная часть
эксперимента начинается сразу после размещения биоконтейнеров с культурами клеток в
термостатах «Биолаборатории М» и на бортовой центрифуге (1 g) при температуре + 37° С
(синхронный контроль). Длительность активного периода эксперимента (сеанса) 7-12 суток.
Параллельно будут поставлен наземный контроль. В конце эксперимента космонавт-оператор
выполняет манипуляции, связанные с химической фиксацией клеточных культур (ампула с
фиксирующей смесью находится внутри биоконтейнера), а также помещает часть биоконтейнеров
с культурами в термостат (+4°С) и холодильник (–15°С). По окончании эксперимента
биоконтейнеры с культурами размещаю в холодильнике транспортировочного устройства
«Биолаборатории М» при температуре (+4°С) и (–15°С) и доставляются на Землю.
3.2 Принципиальные требования к условиям выполнения КЭ
Принципиальными требованиями к проведению, определяющими качество получаемой
информации являются стабильность температурного режима термостата, холодильника,
бесперебойное вращение центрифуги и соблюдение порядка проведения КЭ и доставка
биоконтейнеров с культурами на Землю для целенаправленных исследований согласно научной
программы.
3.3 Технические особенности НА
НА «Биолаборатория-М» является многоцелевой, не имеющей зарубежных аналогов, аппаратурой
для проведения биологических космических экспериментов широкого профиля. Она состоит из
блоков, включающих следующие конструктивные модули:
- бортовой термостат;
- холодильно-морозильный блок;
- центрифугу;
- биоконтейнеры различной конфигурации;
- устройство для фиксации биологического материала;
- автономный блок питания;
- цифровую камеру;
3
- кабели питания и кабели для подключения к ИУС;
- комплект ЗИП.
3.4 Послеполетная обработка и анализ биообразцов
После полёта будет проведена обработка биоматериала и сравнительный анализ полётных и
контрольных (синхронных и наземных) клеточных культур с применением методов световой
микроскопии, электронной микроскопии, фазово-контрастной, конфокальной и люминисцентной
микроскопии, цитоиммунохимии, молекулярно-генетических методов и др., согласно научных
задач. Планируются также провести послеполётные исследования клеточных культур с
использованием
специальных
маркеров
специфических
биосинтезов
для
оценки
пролиферативного и дифференцировочного потенциала, а также метаболической активности
стромальных клеток костного мозга. Полученные в КЭ материалы будут проанализированы с
использованием специализированных программ BioWizard, «Размер 5», Statistica 6.0. Комплекс
методов и их научная информативность адекватны для решения поставленных задач.
4.Новизна, оценка качественного уровня по сравнению с аналогичными отечественными и
зарубежными исследованиями.
КЭ «Област» имеет научную новизну в плане постановки задач исследования и методических
подходов. Высокий качественный уровень исследований предполагает получение новых по
сравнению с имеющимися отечественными и зарубежными разработками данных о роли
гравитационного фактора в дифференцировке остеогенных клеток-предшественников в составе
стромы костного мозга. Результаты исследований позволят дать ответ на выдвигаемую
исполнителями гипотезу о клеточных механизмах ремоделирования в костных структурах и
направленности трансдукции механических сигналов в системе стромально-остеобластноостеоцитарного синцития костной ткани, внесут новое в понимание механизмов влияния факторов
космического полёта на остеогенетические процессы в костном скелете и развитие остеопороза.
5.Ожидаемые результаты и их предполагаемое использование (с указанием области
применения).
5.1 Основные результаты
Будут получены новые для науки данные о гравизависимых изменениях в стромальных клетках
костного мозга, изучены их дифференцировочные потенции, а также особенности пролиферации,
дифференцировки, специфического функционирования остеогенных клеток, некоторые
механизмы их гравичувствительности. Проведен сравнительный анализ данных, полученных на
клеточных культурах стромальных клеток с результатами исследований на тканевом и
организменном уровнях для выяснения взаимодействия в остеогенезе локальных и системных
факторов.
5.2 Предполагаемое использование результатов
Результаты
исследований
об
особенностях
колониеобразования,
ультраструктуры,
дифференцировки и функциональных потенций МСК и их производных – остеогенных клетокпредшественников в условиях микрогравитации послужат основой для разработки методов
диагностики и прогнозирования (тест-системы), а также коррекции патологических состояний
костной ткани, в частности остеопении и остеопороза, развитие которых возможно в условиях
4
длительных космических полётов и при гипокинезии, которая в настоящее время рассматривается
как экосоциальный фактор. Области применения: космическая медицина и биология,
биотехнология, практическая и теоретическая медицина и биология.
6.Обоснование технических возможностей создания НА с заданными характеристиками.
Соисполнители со стороны Украины имеют 35-летний опыт конструирования НА, которая
успешно работала на станциях «Мир» и «Салют» и, опираясь на опыт и оригинальные идеи
украинских ученых в области биологических космических исследований, владеют технической,
технологической и кадровой инфраструктурой для создания аппаратуры «Биолаборатория-М» с
заданными характеристиками.
7.Характеристика рисков и дискомфорта для экипажа, связанных с КЭ.
Риски и дискомфорт для экипажа в связи с выполнением эксперимента «Област» отсутствуют.
Список цитируемой литературы
1.
Buravkova L., Romanov Y., Grigorieva O, Merzlikina N. Cell-to-cell interaction in changed
gravity: ground-based and flight experiments // Acta Astronaut, 2005. – 57 (2-8). – P. 67-74.
2.
Garetto L.P., Morey E.R., Durnova G.N. et al. Preosteoblast production in Cosmos 2044 rats:
shot-term recovery of osteogenic potential // J. Appl. Physiol. – 1992. – 73. – P. 14-18.
3.
Fridenstein A.J., et al. Origin of bone marrow stromal mechanocytes in radiochimeras and
heterotopic transplants // Exp. Hematol., 1978. – V. 6, № 5. – P. 440-444.
4.
Morey-Holton E.R., Wronsky T.J. Animal model for simulating weightlessness // The
Physiologist., 1981. – 24, N 6. – P.45-48.
5.
Noble B.S., Peet E., Stevens H. et al. Mechanical loading: biphasic osteocyte survival and
targeting of osteoclasts for bone destruction in rat cortical bone // J.Physiology – Cell Physiology. – 2003.
– 284, N 4. – P.934-943.
6.
Oganov V.S. The skeletal system, weightlessness, and osteoporosis. M., Firm "Slovo", 2006. –
256 p.
7.
Rodionova N.V., Oganov V.S. Morpho-functional adaptations in the bone tissue under the space
flight conditions // J. Gravit. Physiol., 2001. – vol. 7 (3). – p.72-73.
8.
Rodionova N.V., Oganov V.S. Peculiarity of ultrastucture and 45Ca methabolism of osteoclasts in
condictions of hind limb unloading and microgravity // Vestnik zoology, 2009. – 43 (4). – P. 305-313.
9.
Rodionova N.V., Oganov V.S., Zolotova N.V. Ultrastructural changes in osteocytes in
microgravity conditions // J. Advanc. Space Research, 2002. – vol. 30, № 4. – Р. 775-770.
10.
Rodionova N.V., Oganov V.S. Changes of cell-vascular complex in zones of adaptive remodeling
of the bone tissue under microgravity conditions //J. Advanc. Space Research. USA, 2003. – Vol. 32, №
8, – P. 1477–1482.
11.
Rodionova N.V., Shevel I.M., Oganov V.S., Novikov V.E. Bone ultrastructural changes in Bion
11 Rhesus Monkeys. // J. Gravit. Phisiol., 2000. – vol.7. (1). – р 157-161.
12.
Березовская О.П., Родионова Н.В. Влияние микрогравитации на остеогенные клетки in vivo.
Ультраструктурные исследования // Цитология и генетика. – 1998. – 32, № 4. – С. 3-8.
5
13.
Воложин А.И., Оганов В.С. (Ред) Остеопороз. // Практическая медицина, Москва 2005,
238с.
14.
Газенко О.Г., Григорьев А.Н., Наточин Ю.В. Водно-солевой гомеостаз и космический полет
// Проблемы космической биологии. – М.: Наука, 1986. – Т.54. – 240 с.
15.
Гершович П.М., Гершович Ю.Г., Буравкова Л.Б. Цитоскелет и адгезия культивируемых
стромальных клеток-предшественников костного мозга человека при моделировании эффектов
микрогравитации // Цитология. – 2009. – Том 51, № 11. – С. 896-901.
16.
Григорьев А.И., Воложин А.И., Ступаков Г.П. Минеральный обмен у человека в условиях
измененной гравитации. – М.: Наука, 1994. – Т.74. – 216 с.
17.
Оганов В.С., Бакулин А.В., Новиков В.Е., Мурашко Л.М., Кабицкая О.Е. Изменения
костной ткани человека в космическом полете. О возможных механизмах остеопении //
Остеопороз и остеопатии, 2005. – №2. – С.2-7.
18.
Родионова Н.В. Цитологічні механізми перебудов у кістках при гіпокінезії та
мікрогравітації. – Київ: Наук. думка, 2006. – 239 с.
19.
Родионова Н.В., Оганов В.С. Бабак С.В. Нестеренко О.Н. Ультраструктурные изменения в
остеогенных клетках при действии факторов космического полёта // Український морфологічний
альманах. – 2008. – Т.6, № 1. – С. 219-220.
20.
Родионова Н.В., Оганов В.С. Цитологические механизмы развития остеопороза при
действии факторов космического полёта // Проблемы остеологии. – Т.4 №1-2, Киев 2001. – 4, – С.
135-136.
21.
Родионова Н.В.Функциональная морфология клеток в остеогенезе. – Киев: Наук. думка,
1989. – 186 с.
22.
Родионова Н.В., Богданович Л.В. Колониеобразование стромальных клеток костного мозга
крыс in vitro после экспериментальной гипокинезии // Укр. морф. альманах. – 2005. – № 1. – С. 5355.
6