ПРОФИЛАКТИКА ФОТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ЭНДОВИТРЕАЛЬНЫХ ИСТОЧНИКОВ СВЕТА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)
advertisement
На правах рукописи КАЗИЕВ САБИР НИЗАМИЕВИЧ ПРОФИЛАКТИКА ФОТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ЭНДОВИТРЕАЛЬНЫХ ИСТОЧНИКОВ СВЕТА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) 14.01.07 – глазные болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва - 2013 1 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова» Министерства здравоохранения Российской Федерации Научные руководители: доктор медицинских наук Борзенок Сергей Анатольевич доктор биологических наук Сабурина Ирина Николаевна Официальные оппоненты: Балашевич Леонид Иосифович Доктор медицинских наук, профессор. Действительный член Лазерной АН РФ, Международной академии информатизации, академик Российской академии естественных наук. Большунов Андрей Валентинович Доктор медицинских наук, профессор. Заведующий отделением лазерных методов лечения, академик лазерной АН РФ Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение высшего последипломного образования Российский университет дружбы народов Защита состоится « 9 » декабря 2013 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета по защите докторских диссертаций Д.208.014.01 при ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России по адресу: 127486, г. Москва, Бескудниковский бульвар, д. 59А. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России. «МНТК Автореферат разослан « 8 » ноября 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук В.В. Агафонова 2 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ Вт ИК Лм РПЭ УФ EASC Ватт, единица измерения энергии Инфракрасный Люмен Ретинальный пигментный эпителий Ультрафиолетовый Euro-asian council for standardization, metrology and certification (Евразийский совет по стандартизации, метрологии и сертификации) ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы В начале 1970-х годов возникло новое направление хирургии сетчатки – эндовитреальная хирургия. Благодаря этой технологии появилась возможность проводить операции в самых тяжелых случаях, когда отслойка сетчатки сопровождается грубыми изменениями стекловидного тела при наличии спаек, шварт, гемофтальма (Антелава Д.Н. и др., 1986; Machemer R. et al., 1971). Одним из основных нововведений в области хирургических технологий является создание мощных источников света и эндоиллюминационных систем. Впервые внешний щелевой осветитель был использован в начале 1970 года. В 1976 году G.A. Peyman использовал оптическое волокно, вводимое в полость стекловидного тела, в процессе проведения 20G 3-х портовой витрэктомии. В последующем различные типы широкоугольных эндоиллюминационных источников света стали доступны для использования и стали стандартными инструментами для эндоиллюминации при pars plana витрэктомии. (Peyman G.A., 1976; Ryan E.H., 1997) Новые источники света на основе ксенона и паров ртути значительно увеличили мощность, позволяя достичь достаточной освещенности. Однако естественное желание хирурга достичь наибольшей яркости освещаемой поверхности входит в противоречие с риском фототоксического воздействия на сетчатку, поэтому стремление к максимальной освещенности операционного поля должно быть сбалансировано мерами, защищающими сетчатку от повреждения (Chow D.R., 2011; Smith B.T., Belani S., 2005; van den Biesen P.R. et al., 2000; Friedman E. et al., 1968; Gandorfer A. et al., 2003; Grisanti S. et al., 2004). 3 По мнению ряда авторов, основную фототоксическую опасность для сетчатки представляет свет в ультрафиолетовой (УФ) и фиолетово-синей области спектра. Свет этих длин волн способен запускать деструктивные фотохимические реакции свободно-радикального окисления (Marmor M.F. et al., 1980; Algvere P.V. et al., 2006; Ham W.T. et al., 1980, 1984; Flynn H.W. et al., 1988; Brod R.D. et al., 1989; Rattner A. et al., 2008). Снижению фототоксической опасности для сетчатки способствует использование в хирургическом осветительном оборудовании стандартных фильтров, отсекающих нижние волны спектра и дополнительных фильтров для верхних волн спектра. Однако проведенный анализ многочисленных исследований в области фотоиндуцированных повреждений сетчатки свидетельствует о том что, не смотря на соответствие выпускаемого осветительного оборудования современным международным стандартам технического регулирования и использование светоотсекающих фильтров, ряд авторов отмечает проявление фототоксических эффектов в послеоперационном периоде (Berler D.K., Peyser R., 1983; Dawson W.W., 1976; Azzolini C. et al., 1994; Kremers J.J.M., 1988; Meyers S.M. et al., 1982; Morgan J.I. et al., 2008; Reichel E., 1994; Rossi T. et al., 2009). Использование клеточных культур в качестве тест-систем оценки фототоксического потенциала различных источников света, находясь в рамках, предписанных международными стандартами испытаний биологической безопасности (клеточная концентрация, входящие в состав питательных сред компоненты, условия инкубирования, буферные среды), тем не менее, имеют множество вариаций культивирования и, как следствие, присущие каждой конкретной тест-системе преимущества и недостатки. Использование клеточного материала человека наиболее приближено к определению факторов риска фототоксичности различных источников света, однако получение дифференцированных клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ) имеет высокую вероятность контаминации РПЭ с клетками нейральной сетчатки и элементами стекловидного тела. К тому же исследование фототоксичности in vitro на монослойной культуре РПЭ позволяет прогнозировать только острый фототоксический эффект в тестах in vivo на животных и человеке не выявляя фототоксический потенциал и непрямые механизмы фототоксичности (ЕАSС, 2012; Пеннияйнен В.А., Лопатина Е.В., 2005). В последние годы в экспериментальной биологии значительное внимание уделяется разработке методов культивирования, при которых сохраняется трехмерная структура соматических тканей с характерными для них межклеточными взаимодействиями и поддержанием достаточно длительное время морфологии и функционального состояния. В международной 4 номенклатуре эти методы культивирования обозначаются как 3D-система (three dimensional system). Используемая нами культура клеток РПЭ человека во вторичноприкрепленной 3D (сфероидной) форме позволяет сохранить клетки в эпителизованном функциональном состоянии, что приближает эту модель к нативным тканям. В плотном компактном сфероиде клетки РПЭ сохраняют поляризацию, характерную для эпителиальных тканей, экспрессируя на поверхности ламинин и коллаген, посредством которых хорошо защищены от разного рода воздействий, что кардинально отличает эту культуру от монослойных (2D) культур РПЭ. Однако в настоящее время отсутствуют данные по оценке фототоксического потенциала различных источников света на этой культуре клеток (Сабурина И.Н., Репин B.C., 2010). Таким образом, на сегодняшний день нет единого мнения о величине фототоксической опасности источников эндовитреального освещения, остаются дискутабельными вопросы выбора биологических тест-систем в качестве адекватного объекта исследования in vitro, не определены сроки и порядок проведения экспериментальных исследований культурального материала, актуальными остаются вопросы качественной и количественной подготовки клеточных культур для проведения всесторонней оценки величины и выраженности фототоксической нагрузки. Исходя из вышесказанного, в настоящий момент существует объективная необходимость детального изучения свойств, применяемых осветительных систем и выявление безопасных параметров воздействия, что может быть проведено на монослойной 2D и сфероидной 3D культуре клеток РПЭ человека. Цель исследования. Оценка параметров фототоксического действия ксенонового и ртутного источников света операционных осветителей на морфологические свойства изолированных клеток ретинального пигментного эпителия человека и подбор экранирующего светофильтра в эксперименте. Задачи исследования 1.Провести теоретические расчеты и экспериментальное обоснование биологически опасных и безопасных параметров светового воздействия ксенонового и ртутного источников света на клеточные структуры сетчатки. 2.Исследовать фототоксическое действие ксенонового и ртутного источников света на 2D культуру ретинального пигментного эпителия человека и сфероидную 3D культуру ретинального пигментного эпителия человека. 5 3.Подобрать экспериментальным путем светофильтр, экранирующий культуры клеток ретинального пигментного эпителия человека от повреждающего действия ксенонового и ртутного источников света. 4.Оценить ультраструктурные изменения культуры клеток ретинального пигментного эпителия человека после фототоксического действия ксенонового и ртутного источников света и фотозащитного действия подобранного светофильтра. Научная новизна результатов исследования 1.Впервые показано, что встроенные светофильтры ртутного эндовитреального операционного осветителя допускают до 40% синего излучения в полосе пропускания видимого белого света, что способно оказывать фототоксическое и апоптотическое действие. 2.Впервые показано, что волновые и энергетические параметры ксенонового и ртутного источников света, при временных интервалах свыше 30 минут и расстоянии 5 мм, в культуре клеток ретинального пигментного эпителия человека, являются активаторами дегенеративных процессов индуцированного апоптоза замедленного действия, что проявляется повреждением цитоскелета, клеточных ядер и крипт митохондрий. 3.Впервые установлено, что применение светофильтра, подобранного экспериментальным и расчетным путем, отсекающего синее смещение видимого спектра белого света в интервале длин волн от 410 до 475нм препятствует фототоксическому повреждению линейных 2D и сфероидных 3D культур ретинального пигментного эпителия, вне зависимости от используемого осветителя. Практическая значимость результатов исследования 1.Впервые показано, что клеточные культуры ретинального пигментного эпителия 2D и 3D форм являются адекватными объектами для оценки фототоксического воздействия ртутных и ксеноновых эндовитреальных осветителей и могут применяться для оценки величины фототоксической опасности в хирургическом осветительном оборудовании. 2.Светоиндуцированные фотоповреждения, вызванные современным хирургическим осветительным оборудованием, не провоцируют быстрой гибели клеточных культур, однако накопление факторов апоптоза замедленного типа способно оказывать патологическое влияние в течение длительного периода после оперативного вмешательства, а значит необходима интра- и 6 послеоперационная патогенетически ориентированная терапия у этой категорией пациентов. 3.Осветители, используемые в ходе оперативного вмешательства, должны содержать фильтр, отсекающий свет в интервале длин волн не менее 480 нм для предупреждения или снижения фототоксической опасности. Спектр предложенного светофильтра приближен к спектру пропускания естественного хрусталика человека с характерной точкой 50-ти % пропускания на λ 450 нм, практически не ослабляет свет в основной видимой области λ 500 – 700 нм, а так же ослабляет свет в области фототоксического повреждения (при λ 400 – 500 нм) на 30% и может быть рекомендован для применения в хирургическом осветительном оборудовании «Photon II» и «Accurus 800DS», а также в других осветителях любого типа нового поколения со сходными характеристиками светового потока. Основные положения, выносимые на защиту 1.На основании физических методов исследования определен диапазон спектра светового воздействия ксенонового и ртутного источников эндовитреального освещения на клетки ретинального пигментного эпителия человека, которые индуцируют фототоксический эффект, но которые не нивелируются встроенными светофильтрами. 2.Светофильтр, найденный экспериментальным и расчетным путем с отсечением длин волн короче 475 нм, препятствует фототоксическому апоптотическому действию света и позволяет увеличить время безопасной световой экспозиции. 3.Тест-система, созданная на основе сфероидной 3D-культуры клеток ретинального пигментного эпителия человека, является наиболее информативной по оценке воздействия на ультраструктурном уровне повреждающего действия ксенонового и ртутного света операционных эндоосветителей и позволяет оценить светоиндуцированные субклеточные апоптические нарушения ретинального пигментного эпителия по повреждениям цитоскелета, клеточных ядер, крипт митохондрий. Внедрение в практику Результаты исследований внедрены в работу операционных блоков головной организации ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России, Центра фундаментальных и прикладных медикобиологических проблем Учреждения и Лаборатории клеточной биологии и патологии развития ФГБУ НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН. 7 Результаты диссертационной работы используются в лекционных курсах для клинических ординаторов, аспирантов и курсантов Научно-педагогического центра ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н.Федорова» Минздрава России. Апробация работы Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Федоровские чтения – 2013» (Москва, 2013) и научно-практических конференциях ФГБУ «МНТК «МГ» им. акад. С.Н. Федорова» (Москва, 2012, 2013). На Всероссийской научной конференции с международным участием «Федоровские чтения» (2013) доклад на тему: «Экспериментальное исследование безопасности и профилактики фототоксического действия эндовитреальных источников света» занял первое место. Публикации По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 3 – в журналах, рецензированных ВАК РФ. Структура и объем диссертации Диссертационная работа изложена на 96-ти страницах машинописного текста; иллюстрирована 5-ю таблицами, 19-тью рисунками. Работа состоит из введения и 4-х глав, включающих литературный обзор, материалы и методы исследования, 2-х глав результатов собственных исследований, содержит заключение, выводы и практические рекомендации. Список литературы включает 155 источников, из них 15 - отечественных и 140 - иностранных. Культивирование клеток РПЭ человека и изучение полученных в ходе исследования препаратов с последующей фоторегистрацией осуществляли на базе Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России (руководитель – д.м.н. Борзенок С.А.) и на базе лаборатории клеточной биологии и патологии развития ФГБУ НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН (руководитель – д.б.н. Сабурина И.Н.). Теоретические расчеты и экспериментальное обоснование параметров светового воздействия ксенонового и ртутного источников света, исследование защитных свойств светофильтра подобранного экспериментальным и расчетным путем от повреждающего действия ксенонового и ртутного 8 источников света проводились на базе лаборатории физико-химических основ рецепции Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН (зав. лабораторией – д.б.н., профессор, академик РАН Островский М.А.). СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Работа носила экспериментальный характер и состояла из двух этапов. На первом этапе работы изучались оптические характеристики источников эндовитреального освещения, на основе которых были выполнены теоретические расчеты подбора экранирующего светофильтра. На втором этапе работы проводилось экспериментальное исследование биологических параметров источников эндовитреального освещения. По результатам оценки 200 эндовитреальных хирургических вмешательств, проведенных различными хирургами на базе МНТК «МГ» (Москва) в 2011 и 2012 гг, нами были выявлены наиболее предпочтительные источники эндовитреального освещения, использующиеся при различных болезнях сетчатки. Исходя из полученных данных, для проведения экспериментального исследования были выбраны наиболее часто используемые эндовитреальные осветители «Accurus» 800 DS (белый ксеноновый свет) и «Photon» II (ртутный зеленый свет). Осветители «Constellation», «Stellaris PC» и «Associate» имеют идентичные параметры цвето и светопередачи на основе ксенононовой лампы накаливания, однако их низкое количественное соотношение (на момент проведения исследования) по сравнению с указанными осветителями обуславливает невысокую частоту использования. На первом этапе экспериментального исследования проводилось измерение физических параметров источников эндовитриального освещения методом спектрофотометрии (AvaSpec-2048, Нидерланды). На втором этапе работы в качестве биологических тест-систем были использованы культуры клеток РПЭ человека. Клетки РПЭ получали из эксплантатов посмертного материала, предоставленного криобанком центра фундаментальных и прикладных медикобиологических проблем ФГБУ МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н.Федорова» Минздрава России и Лаборатории клеточной биологии и патологии развития ФГБУ НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН. Полученные для дальнейшего эксперимента культуры РПЭ представляют собой генетически однородную популяцию клеток, растущих в постоянных условиях. 9 Клетки РПЭ человека культивировали в стандартных условиях. Перед заменой среды культуры РПЭ микроскопировали с помощью инвертированного светового микроскопа CKX 41 (Olympus, Япония), оценивая степень конфлуэнтности, фоторегистрацию осуществляли с помощью цифровой камеры Invenio (Olympus, Япония). Подсчет клеток при пассировании культуры производили с использованием автоматического счетчика клеток Countess (Invitrogen, США). В экспериментальных сериях использовали первичные культуры РПЭ третьего пассажа (2D культура РПЭ), достигшие 80-90% конфлуэнтности. Для получения клеточных сфероидов – 3D культур использовали метод «висячая капля». Количество клеток подсчитывали при помощи автоматического счетчика клеток Countess или в камере Горяева. Иммунофенотипирование культур клеток РПЭ человека проводили с помощью проточного цитофлуориметра (Beckman coulter FC 500, США). Исследование проводили на 2-х культурах клеток РПЭ: монослойная 2D культура (n=60) и вторичноприкрепленная 3D культура (n=44). Исследуемые культуры клеток РПЭ были разделены на 4 группы: опытная 2D культура (n=30), контрольная 2D культура (n=30), опытная 3D культура (n=22), контрольная 3D культура (n=22). Каждая исследуемая группа разделена на 4 подгруппы в зависимости от источников воздействия на клеточные культуры РПЭ и использования подобранного светофильтра (таблица 1). Таблица 1 Распределение экспериментального материала по виду воздействия источников освещения на клеточные культуры Группы Культура клеток РПЭ Ксеноновый осветитель Ксеноновый осветитель + светофильтр Ртутный осветитель Ртутный осветитель + светофильтр Опыт 2D РПЭ 9 6 9 6 Контроль 2D РПЭ 9 6 9 6 Опыт 3D РПЭ 9 2 9 2 Контроль 3D РПЭ 9 2 9 2 В опытных группах 2D и 3D культуры клеток РПЭ освещали ксеноновым и ртутным источниками света. Контрольные группы оставались интактными. 10 Ввиду того что при исследовании 3D культура клеток РПЭ на протяжении эксперимента демонстрировала высокую устойчивость к воздействию ксеноновым и ртутным осветителями было решено для оценки фотопротекторного действия светофильтра подобранного расчетным путем экспериментальные и контрольные группы 3D РПЭ освещать в течении только 30 и 40 минут (2 чашки - контроль, 2 чашки - опыт) Мощность осветителя (50% от максимума) выбрана как среднее от наиболее часто используемых величин, находящихся в диапазоне 40%-60%. Время экспозиции составляло от 10 до 50 минут однако, при оценке фототоксического эффекта освещения и фотопротекторного действия светофильтра учитывался временной интервал от 10 до 40 минут (40 минутмаксимальное время воздействия согласно стандарту ЕАSC). Световод закрепляли в штативе на расстоянии 5мм от поверхности. Расстояние 5 мм подобрано как минимальное расстояние, от наконечника световода до освещаемой поверхности, используемое в витреоретинальной хирургии. Для определения живых и мертвых клеток после облучения монослоя клеток и сфероидных 3D культур РПЭ использовали йодид пропидия (1,7 мкмоль/мл, 15 мин, 25оС). Полученные препараты изучали под люминесцентным инвертированным микроскопом CKX 41 (Olympus, Япония) в видимом и УФ световых диапазонах. Изображения были получены с помощью цифровой камеры Olympus Invenio (Olympus). Для анализа клеточных культур методами электронной микроскопии экспериментальным засветам подвергались 16 чашек, в которых находилось по 3-5 крупных сфероидов диаметром 75-120 мкм. Чашки распределялись следующим образом: 8 чашек для ртутного и 8 чашек для ксенонового излучения, из них по 4 чашки эксперимента и 4 чашки контроля; в свою очередь по 2 чашки без светофильтра и по 2 чашки со светофильтром. В ходе эксперимента чашки с контрольными культурами облучению не подвергались и находились в комнатных условиях в течение всего периода облучения парных чашек. Далее все чашки с опытом и контролем помещались в СО2-инкубатор на 30 суток, после чего из каждой чашки отбирались по 3 сфероида и производились ультратонкие срезы каждого образца с последующим электронно-микроскопическим исследованием с помощью просвечивающего электронного микроскопа JEM-100B (Япония). Для изучения препаратов с использованием метода растровой электронной микроскопии сфероидные 3D культуры после фиксации и обезвоживания высушивали в критической точке и перед сеансом образец напыляли в вакууме золотом, получая реплику (отпечаток), повторяющую контуры образца, которую впоследствии 11 сканировали с использованием сканирующего электронного микроскопа CamScan MX 2500S (Англия). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Результаты экспериментальных исследований физических параметров источников эндовитреального освещения Спектральный анализ излучения ртутного осветителя показал, что избыточная синяя полоса спектра излучения начинается от 435 нм и в значительной степени захватывает известный спектр действия фотохимического синего повреждения (420 – 500 нм) РПЭ. При этом доля синего излучения, согласно измерениям, составляет около 40% из общего излучения осветителя. Другими словами, такое освещение создает безусловный неоправданный риск фотохимического повреждения РПЭ (рис. 1). Рис.1. Спектр излучения ртутного осветителя, синим цветом обозначен спектр действия фотохимического синего повреждения Измерения параметров ксенонового осветителя (рис. 2) показали непрерывный спектр излучения лампы осветителя с плавным повышением от синей к красной области спектра. Доля синего излучения в общем спектре составляет около 25% и представляется менее опасной для РПЭ пациента, чем у ртутного осветителя. 12 Абсолютная мощность обоих осветителей в полосе 400 нм - 700 нм практически одинакова, и составляет 10 - 11 мВт/cм2. Освещенность, создаваемая ртутным светом составляет около 12 000 лк, ксеноновым – 6000 лк. В синей полосе фототоксического излучения 400–500 нм, мощность излучения ртутного осветителя в 1,3 раза выше, чем у ксенонового. 480nm--- Рис.2. Спектр излучения ксенонового осветителя, максимум спектра действия фотохимического синего повреждения находится на отметке 480 нм Указанные недостатки осветителя можно было бы в значительной степени нейтрализовать путем доукомплектования осветителя дополнительным светофильтром, ослабляющим избыточную часть синего света. Логичным вариантом такого светофильтра является светофильтр, аналогичный по спектру естественному хрусталику глаза. Результаты экспериментального исследования светофильтра подобранного экспериментальным и расчетным путем Спектр подобранного светофильтра приближен к спектру пропускания естественного хрусталика человека с характерной точкой 50-ти% пропускания на 450 нм. Согласно приведенным спектрам (рис.3), использованный светофильтр практически не ослабляет свет в основной видимой области: 500 – 700 нм, но в области фототоксического фотоповреждения (400 – 500 нм) ослабляет свет на 30%. Согласно полученным спектрам сопоставления излучения ртутного осветителя в исходном состоянии и с применением светофильтра, аналогичного по спектру пропускания естественному хрусталику глаза (рис. 4), показано, что использованный светофильтр в области фототоксического повреждения (400 – 13 500 нм) ослабляет свет на 30% не затрагивая основной видимой области спектра: 500 – 700 нм. Рис.3. Спектр светпропускания дополнительного светофильтра для ослабления синей составляющей спектров излучения осветителей Рис. 4. Сопоставление излучения ртутного осветителя в синей области спектра в исходном состоянии (черная кривая) и с применением светофильтра, аналогичного по спектру пропускания естественному хрусталику глаза (голубая кривая) При сопоставлении излучения ксенонового осветителя в синей области спектра в исходном состоянии и с применением светофильтра показано, что использованный светофильтр в области фототоксического повреждения (400 – 500 нм) ослабляет свет в 1,5 раза (рис. 5). Красной пунктирной кривой обозначена граница между фототоксическим диапазоном (400 – 500 нм) и основным видимым диапазоном (500 – 700 нм). 14 Рис. 5. Сопоставление излучения ксенонового осветителя в синей области спектра в исходном состоянии (коричневая кривая) и с применением светофильтра (оранжевая кривая) Таким образом, применение светофильтра подобранного расчетным путем оказывает непосредственное влияние на ширину полосы светопропускания в фототоксическом диапазоне длин волн, и позволяет снижать световую нагрузку на сетчатку. Результаты экспериментальных исследований биологических параметров источников эндовитреального освещения В результате экспериментальных исследований биологической безопасности светового воздействия ксеноновым и ртутным источниками света на 2D культуре и сфероидной 3D культуре РПЭ установлено процентное соотношение показателей гибели клеток, коррелирующее со временем экспозиции, типом клеточной культуры и применяемым осветителем. Так при освещении 2D культуры РПЭ ртутным осветителем во временном интервале 30 минут, гибель клеток в экспериментальной группе составила 0,91%, тогда как в контрольной группе этот показатель составил лишь 0,16%. Через 40 минут в экспериментальной группе показатель гибели клеток - 1,69%, контрольная группа характеризуется меньшим показателем гибели клеток 0,35%. При освещении 2D культуры РПЭ ксеноновым светом, во временном интервале 30 минут, гибель клеток в экспериментальной группе составила 0,66%, после 40 минут воздействия - 1,72%. Контрольная группа в этих сериях характеризуется отсутствием гибели клеток. 15 При освещении сфероидной 3D культуры РПЭ ртутным зеленым светом, не выявлено погибших клеток через 30 и 40 минут экспозиции. В контрольной группе гибель клеток не обнаружена. Аналогичный результат наблюдался при освещении сфероидной 3D культуры РПЭ ксеноновым светом, гибель клеток не выявлена при 30 и 40 минутах световой экспозиции. В контрольной группе гибель клеток не обнаружена. Полученные данные свидетельствуют о чувствительности использованных нами тест-систем (2D и 3D культуры РПЭ) к световому воздействию. В монослойных культурах гибель клеток обнаружили уже после 30 минутной экспозиции, тогда как сфероидные 3D культуры оказались устойчивее к действию осветителей. Результаты фотозащитного действия светофильтра на 2D и сфероидную 3D культуры клеток ретинального пигментного эпителия Подобранный экспериментальным и расчётным путем светофильтр с характерной точкой 50-ти % пропускания на 450 нм, применяемый в ходе экспериментального воздействия ртутным светом осветителя, во временном интервале 40 минут, на культуре клеток РПЭ снижал гибель клеток в экспериментальной группе с 1,69% без светофильтра до 0,32% с использованием светофильтра. В контрольной группе показатели гибели клеток не изменялись и составили 0,18% через 30 минут, 0,62% через 40 минут. При освещении сфероидной 3D культуры РПЭ ртутным зеленым светом со встроенным светофильтром, при всех сроках экспозиции (30 и 40 минут) гибель клеток в экспериментальной и контрольной группах отсутствовала. При освещении 2D культуры РПЭ ксеноновым светом со встроенным светофильтром процент гибели клеток в экспериментальной группе через 30 минут воздействия составил 0,49%, через 40 минут – 1,3%. В контрольной группе гибель клеток не обнаружена. При освещении сфероидной 3D культуры РПЭ ртутным светом со встроенным светофильтром, в экспериментальной и контрольной группах после 30 и 40 минут воздействия гибель клеток не обнаружена. При освещении сфероидной 3D культуры РПЭ ксеноновым светом осветителя со встроенным светофильтром, в экспериментальной и контрольной группах после 30 и 40 минут воздействия гибель клеток не обнаружена. Таким образом, показатели гибели клеток в группе 2D культуры РПЭ подвергавшейся воздействию ксеноновым светом со встроенным 16 светофильтром снизились в среднем на 0.17% после 30 минут экспозиции и на 0,42% после 40 минут светового воздействия. Для ртутного осветителя использование светофильтра позволило снизить гибель клеток 2D культуры в среднем на 0,73% после 30 минут воздействия и на 1,37% после 40 минут экспозиции. Использование светофильтра позволило существенно снизить гибель клеток РПЭ в 2D культуре и достичь в экспериментальной группе показателей гибели клеток, не отличающихся от значений в контрольной группе. Клетки РПЭ в 2D культуре при анализе жизнеспособности оказались чувствительнее вторичноприкрепленной 3D культуры. Тест-система – монослойная 2D культура РПЭ хорошо подходит для анализа светового воздействия на жизнеспособность клеток. 3D культура РПЭ – сфероиды, в которых клетки сохраняют эпителиоподобный фенотип и экспрессию меланина, лучше, чем 2D культура моделирует ткань нативного глаза. На модели сфероидной 3D культуры мы не выявили отличий в экспериментальных и контрольных группах по гибели клеток после светового воздействия, как с использованием светофильтра, так и без него. Гибель клеток путем апоптоза первоначально не связана с нарушением целостности мембран, лизирование мембраны клетки идет на терминальных стадиях апоптотической гибели. Апоптоз является энергетически-зависимым каскадом молекулярных событий: инициации, контроля и интеграции, экзекуции, фагоцитоза. Первый этап инициация – прием сигнала, предвестника гибели, поступающего извне или возникающего в самой клетке. Сигнал анализируется, передается через рецепторы и молекулы посредники и поступает в ядро, где происходит включение программы клеточной гибели путем активации проапоптотических и/или репрессии антиапоптотических генов (Hengartner M.O., 2000). Световое воздействие может активировать первые этапы инициации и начала фазы экзекуции на рассматриваемом в нашем исследовании сроке – через сутки после световой экспозиции. Чтобы оценить вклад апоптотической гибели в нарушения, вызванные световым воздействием, в последующих экспериментальных сериях мы с использованием методов электронной микроскопии оценивали ультраструктурные изменения клеток РПЭ после фотоэкспозиции. 17 Результаты морфологического исследования ультаструктуры клеток РПЭ после фототоксического действия ксенонового и ртутного источников света В экспериментах на 2D и 3D культурах РПЭ человека нами была определена безопасная экспозиция работы ртутного и ксенонового осветителей в штатных режимах по показателю гибели клеток (некрозу). При этом при экспозиции до 30 мин при использовании обоих облучателей показатель гибели клеток не превышал 0%, но после 40 мин освещения показатель гибели клеток в культуре 2D ретинального пигментного эпителия составил для ртутного источника 1,69% (в контроле без облучения 0,35%), для ксенонового источника – 1,72% (в контроле без облучения 0%). Однако в культуре 3D ретинального пигментного эпителия показатель гибели клеток во всех случаях равнялся 0%. Также нами была установлена высокая эффективность светозащитного действия подобранного расчетным путем светофильтра с характерной точкой 50%-ного пропускания на длине волны 450 нм. Так в 2D культуре после 40 мин экспозиции ртутным источником освещения показатель гибели клеток составил 0,32% (в контроле без облучения – 0,62%), ксеноновым источником освещения – 1,3% (в контроле без облучения – 0%), Однако в 3D культуре показатель гибели клеток также равнялся 0%. По нашему мнению, такой результат не означает отсутствия эффекта фототоксической индукции апоптоза, что потребовало проведения дополнительного исследования на медленную гибель клеток (апоптоз) путем электронномикроскопического изучения характерных для апоптоза морфологических признаков. Сферическая форма 3D РПЭ позволяет повысить устойчивость клеточной культуры к дестабилизирующим факторам внешней среды, сохраняя при этом эпителизованное функциональное состояние, что с одной стороны обьединяет эту клеточно-тканевую структуру с нативными тканями РПЭ, а с другой обуславливает ее отличие от плоскостной 2D РПЭ. В связи с кардинальным отличием монослойной 2D от сфероидной 3D культуры этой для исследования морфологических эквивалентов апоптоза с помощью электронной микроскопии после светового воздействия нами была выбрана 3D клеточно-тканевая культура сфероидов. В результате электронно-микроскопических исследований на признаки апоптоза культивированных сфероидов в эксперименте с облучением ртутным и ксеноновым источниками света и экранирующим светофильтром показано, что в 2-х образцах сфероидов, облученных ртутным источником света с экспозицией до 40 минут, были выявлены типичные морфологические признаки 18 апоптоза. Причем один образец имел признаки II стадии развития апоптоза, а другой- IV, конечной стадии, граничащей с признаками некроза. Вторая стадия апоптоза характеризовалась наличием апоптозных телец сферической, овоидной и неправильной формы, ограниченных цитоплазматической мембраной. Количество, размер и состав апоптозных телец в клетках был разный, при этом некоторые апоптозные тельца содержали по одному и более фрагментам ядра, которые в ряде случаев были окружены ободком конденсированной цитоплазмы. Другой образец из этой серии облучения имел клетки, находящиеся на третьей стадии развития апоптоза. Мы отмечали наличие признаков фагоцитоза образованных апоптозных телец, при этом фагоцитоз осуществлялся не макрофагами, функция которых известна in vivo, а окружающими неповрежденными клетками ретинального пигментного эпителия. В клетках ПРЭ, участвующих в апоптозе телец, были выявлены признаки лизосомального полимегитизма, как характерного признака фагоцитарной функции эпителиальных клеток. В опытной серии с облучением ксеноновым светом только в одном образце из 6 сфероидов нами были обнаружены признаки развития апоптоза на четвертой стадии развития. Она характеризовалась наличием большого количества остаточных, непереваренных, апоптозных телец с плохо выраженной сохранностью их структуры вследствие интенсивной атаки лизосомальных ферментов. Необходимо отметить, что в контрольных образцах, облученных ртутным и ксеноновым светом ни в одном случае явлений апоптоза не наблюдалось. Во второй серии экспериментов с подобранным нами экранирующим светофильтром только в одном образце при облучении ртутным источником света были обнаружены начальные признаки развития апоптоза, которые можно оценить как первую стадию. В некоторых клетках отмечалось агрегация ядерного хроматина в виде глыбок разного размера, больше крупных, которые располагались с внутренней стороны ядерной цитоплазматической мембраны, при этом контуры ядра были извитыми и имели неправилную форму. В некоторых образцах наблюдали ядрышко увеличенной в размерах формы и с укрупненными гранулами. В некоторых срезах вблизи центра ядра мы отмечали его разделение на несколько фрагментов, содержащих глыбки конденсированного хроматина в разных количествах. В одних клетках хроматин занимал всю поверхность среза такого фрагмента, в других – в виде полусфер на отдельных участках ядерной мембраны, которая в некоторых случаях двойным слоем окружала фрагменты этих ядер. В контрольных образцах сфероидов, облученных обоими источниками света с применением 19 экранирующего светофильтра мы также ни в одном случае не обнаружили морфологических признаков, характерных для апоптоза. Таким образом, полученные результаты могут свидетельствовать о том, что фототоксическое действие ртутных и ксенонового эндовитреальных источников света может проявлятся не сразу в условиях организма. Это связано с явлением медленной гибели клеток, которая программируется экстремальными факторами, и к которым относится фототоксическое действие света, при этом ртутный источник света в связи с более выраженной составляющей синего спектра в большей мере запускает программированную гибель клеток, тому свидетельство – наличие признаков апоптоза в двух образцах облученных сфероидов. При наличии таковых изменений только в одном образце, облученном ксеноновым светом. Иная картина была обнаружена нами при облучении образцов сфероидов двумя источниками света, но с использованием экспериментально подобранного нами экранирующего светофильтра. Только в одном случае нам удалось обнаружить начальные признаки апоптоза, характерные для первой стадии, в одном образце сфероидов, облученных ртутным источником света причем обнаруженные морфологические признаки можно расценивать и как отдаленную медленную гибель клеток, и как случайную находку естественного умирания клетки в процессе 30-дневного инкубирования экспериментального материала. Таким образом, с помощью методов электронной микроскопии удалось подтвердить фототоксическое действие ртутного и ксенонового интраокулярных источников света при их использовании в штатных режимах до 40 минут. А так же показана необходимость обязательного применения экранирующего светофильтра с характеристикой 50%-ного отсечения в спектральном диапазоне 400-480нм. Выводы 1.С помощью теоретических расчетов установлено, что абсолютная мощность ртутного и ксенонового осветителей в полосе пропускания 400-700 нм, практически одинакова и составляет 10-11 мВт/см2. При этом освещенность, создаваемая ртутным источником равна 12000 Лк, а ксеноновым – 6000 Лк; при этом мощность излучения ртутного источника в синей полосе пропускания 400500 нм в 1,3 раза превышает таковую ксенонового осветителя, что требует нейтрализации путем подбора соответствующего светофильтра. 2.Методом морфометрического исследования 2D и 3D культур ретинального пигментного эпителия человека определена безопасная 20 экспозиция работы ртутного и ксенонового осветителей в штатных режимах с расстоянием световода в 5 мм при облучении в пределах 24 Дж, которая составляет не более 30 мин (в обоих случаях показатель гибели клеток не превышал 0%); после 40 мин освещения показатель гибели клеток составил: в культуре 2D ретинального пигментного эпителия для ртутного источника 1,69% (в контроле без облучения 0,35%), для ксенонового источника – 1,72% (в контроле без облучения 0%), в культуре 3D ретинального пигментного эпителия показатель гибели клеток не превышал 0%. 3.В эксперименте на 2D и 3D культурах ретинального пигментного эпителия человека показана высокая эффективность светозащитного действия подобранного расчетным путем светофильтра с характерной точкой 50%-ного пропускания на длине волны 450 нм: в 2D культуре после 40 мин экспозиции ртутным источником освещения показатель гибели клеток составил 0,32% (в контроле без облучения – 0,62%), ксеноновым источником освещения – 1,3% (в контроле без облучения – 0%), в 3D культуре показатель гибели клеток не превышал 0%. 4.Электронно-микроскопическое исследование ультраструктуры клеток ретинального пигментного эпителия человека в 3D культуре, максимально приближенной к морфофункциональному эквиваленту нативной сетчатки, после облучения ртутным и ксеноновым осветителями после 40 мин экспозиции у 50% экспериментальных образцов выявило наличие типичных признаков апоптоза I и II стадий; в эксперименте со светофильтром и в контроле без облучения морфологических признаков апоптоза в клетках ретинального пигментного эпителия 3D культур не выявлялось. Практические рекомендации 1.Согласно требованиям межгосударственных стандартов по техническому регулированию, метрологии и сертификации интраокулярные осветители, используемые при витреоретинальных операциях, должны содержать фильтр, отсекающий свет в интервале длин волн 400-480 нм для предупреждения фототоксического повреждения клеток сетчатки. При оценке спектрального состава ксенонового и ртутного осветителей с применением стандартных светофильтров нами выявлено смещение спектра в область синего света для ртутного осветителя – с максимумом длины волны 435 нм, для ксенонового осветителя – с максимумом длин волн 460 и 480 нм. С учетом выше приведенных параметров при штатных режимах интраокулярного освещения ксеноновым и ртутным операционными осветителями с применением стандартного светофильтра, с рабочим расстоянием наконечника 21 световода не менее 5 мм и энергией светового потока 24 Дж время безопасной световой экспозиции должно составлять не более 30 минут. 2.При выполнении витреоретинальных вмешательств с использованием ртутного и ксенонового осветителей с экспозицией более 40 мин для коррекции спектрального состава фотоповреждающих длин волн (400-480 нм) необходимо использовать предложенный нами отсекающий светофильтр, спектр которого приближен к спектру пропускания естественного хрусталика человека. Светофильтр имеет характерную точку 50%-ного пропускания на пике длины волны 450 нм, практически не ослабляет световой поток в эффективной видимой области (500-700 нм), но на 30% ослабляет свет в области фототоксического повреждения (400 – 480 нм). 3.Для биологического тестирования на фототоксическую безопасность вновь предлагаемых интраокулярных ртутных и ксеноновых осветителей и отсекающих светофильтров наиболее адекватными объектами являются плоскостные (2D) и сфероидные (3D) клеточные культуры ретинального пигментного эпителия человека. Для оценки величины фототоксической опасности и экранирующей способности отсекающих светофильтров необходимо проводить морфометрические и электронно-микроскопические исследования 2D и 3D культур ретинального пигментного эпителия человека на наличие признаков некроза и апоптоза клеток. Список публикаций по теме диссертации 1.Егорова Э.В., Узунян Д.Г., Тилляходжаев С.С., Порханова А.В., Винник Н.А., Горин А.А., Казиев С.Н. Пред- и интраоперационная диагностика патологии периферии сетчатки у больных с макулярными разрывами // Офтальмохирургия.— 2011.— № 4.— С. 28-31. 2.Егорова Э. В., Узунян Д. Г., Винник Н. А., Казиев С. Н. Ультразвуковая биомикроскопия в диагностике патологии периферии сетчатки и прилежащего стекловидного тела у пациентов с периферическими дистрофиями сетчатки // Офтальмология. - 2012. - №1. - С. 63-66. 3.Казиев С.Н., Борзенок С.А., Сабурина И.Н., Кошелева Н.В., Тонаева Х.Д. Эндоиллюминация в ходе витреальной хирургии - эволюция вопроса и особенности применения на современном этапе // Практическая медицина. 2013. - №1-3 (70). - С. 10-12. 4.Казиев С.Н., Борзенок С.А., Сабурина И.Н., Кошелева Н.В., Зурина И.М., Тонаева Х.Д., Кравчук О.В. Экспериментальное исследование безопасных параметров светового воздействия эндовитреальных источников освещения на культуре клеток пигментного эпителия человека // 11-я международная 22 конференция «Высокие медицинские технологии XXI века ». Сб. тезисов Бениндорм - 2012. - С. 42. 5.Борзенок С.А., Казиев С.Н., Арбуханова П.М., Тонаева Х.Д., Сабурина И.Н., Кошелева Н.В. Экспериментальное исследование фототоксического действия ксенонового и ртутного источников света на 2D и 3D культуру ретинального пигментного эпителия человека // Федоровские чтения-2013. XI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием. Сб. тезисов – М., 2013. – С. 140-141. Биографические данные Казиев Сабир Низамиевич, 1985 года рождения, в 2007 году окончил Дагестанскую государственную медицинскую академию по специальности «Лечебное дело». С 2007 по 2009 гг проходил обучение в клинической ординатуре по специальности «офтальмология» на базе ФГБУ «МНИИ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России. С 2009 по 2013 гг обучался в очной аспирантуре на базе ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России. 23
